【摘 要】
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目的:探究二甲基甲酰胺（dimethylformamide,DMF）对小鼠卵母细胞和植入前胚胎发育的影响,以及褪黑素（melatonin,MT）能否拮抗DMF对小鼠卵母细胞的毒性作用。方法:1.采集小鼠GV期卵母细胞,将它们随机移入不同DMF浓度(10-9 g/ml,1%（v/v）,2%（v/v）,5%（v/v）,10%（v/v）)的M16培养液中和对照组（未添加DMF）的M16培养液中,经过14
【基金项目】
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国家重点研发计划“植入前胚胎发育的调控网络研究”（No.2018YFC1004000）；
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目的:探究二甲基甲酰胺（dimethylformamide,DMF）对小鼠卵母细胞和植入前胚胎发育的影响,以及褪黑素（melatonin,MT）能否拮抗DMF对小鼠卵母细胞的毒性作用。方法:1.采集小鼠GV期卵母细胞,将它们随机移入不同DMF浓度(10-9 g/ml,1%（v/v）,2%（v/v）,5%（v/v）,10%（v/v）)的M16培养液中和对照组（未添加DMF）的M16培养液中,经过14 h-16 h的体外培养后,观察不同DMF浓度中卵母细胞第一极体排出（PBE）率,并选取合适的浓度作为DMF实验组。2.收集DMF组和对照组的卵母细胞,观察DMF对卵母细胞基因表达,纺锤体和染色体排列,线粒体分布和活性,氧化磷酸化水平,高尔基体和内质网分布,组蛋白修饰和体外受精的影响。3.将收集的GV期卵母细胞随机移入到对照组（不加入DMF和MT）,“1%DMF组”,“2%DMF组”,“1%DMF+MT组”和“2%DMF+MT组”,观察MT对1%和2%这两组DMF浓度处理的卵母细胞PBE率。4.观察MT能否改善卵母细胞线粒体质量和降低其活性氧水平。5.采集受精卵并将其移入到添加DMF的KSOM培养液（实验组）和不加DMF（对照组）的KSOM培养液中进行体外培养并观察DMF对胚胎分裂和囊胚率的影响。6.观察DMF对胚胎的线粒体,活性氧水平和合子基因组激活相关因子ZSCAN4和MERVL蛋白水平的影响。结果:1.实验数据表明10-9 g/ml组,1%和2%组的卵母细胞PBE率与对照组相比均有所降低,其中2%组的PBE率降低最明显,而在5%和10%这两组中的卵母细胞几乎全部死亡。2.RNA-seq分析发现两组有3242个差异表达基因,其中上调基因有1540个,下调基因有1702个。DMF组的卵母细胞染色体排列和纺锤体构建杂乱,线粒体受损;活性氧水平明显上升;内质网和高尔基体分布异常;部分组蛋白修饰（H3K9me3,H3K9ac,H3K27ac和H4K16ac）水平降低。DMF组卵母细胞受精失败,而对照组的卵母细胞受精成功。3.1%DMF+MT组的PBE率相较于1%DMF组有明显升高,但仍低于对照组卵母细胞PBE率;而2%DMF+MT的PBE率较2%DMF组PBE率无明显区别。4.1%DMF+MT组卵母细胞与1%DMF组相比,线粒体膜电位明显升高,线粒体均匀分布,活性氧水平降低。5.实验组大部分受精卵阻滞在2细胞时期,少数可发育到4细胞;对照组囊胚率为81.44%。6.与对照组相比,DMF处理后的2细胞胚胎线粒体膜电位降低,线粒体异常分布和活性氧水平升高。DMF处理后的二细胞胚胎中的合子基因组激活相关因子ZSCAN4和MERVL的蛋白水平相较于对照组明显降低。结论:1.二甲基甲酰胺暴露引起卵母细胞部分基因表达改变,纺锤体和染色体结构紊乱,线粒体分布及活性异常,氧化应激增强,内质网和高尔基体分布异常,部分组蛋白修饰降低,从而导致小鼠卵母细胞体外成熟阻滞和受精失败。2.褪黑素可以挽救低浓度1%DMF处理的部分卵母细胞成熟阻滞,而对2%DMF组则没有挽救效果。褪黑素提高了1%DMF处理的卵母细胞的线粒体质量,降低活性氧的水平。3.二甲基甲酰胺暴露导致胚胎线粒体分布异常,线粒体膜电位降低,诱导氧化应激发生。以及合子基因组激活相关因子ZSCAN4和MERVL蛋白水平降低,从而进一步引起植入前胚胎发育阻滞。
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