背景与目的结肠癌是消化道常见的恶性肿瘤,且发病有逐年上升的趋势,且结肠癌是目前了解最清楚的恶性肿瘤之一,但它仍占国内肿瘤死因的第4～6位,这就意味着目前的治疗仍不能将肿瘤中的某些细胞彻底根除。结肠癌对标准治疗的逐渐耐药促使人们越来越重视这样的假说,也就是结肠癌是由变异的癌干细胞推动的。近年来,许多证据证明在结肠癌的发生发展机制中有结肠癌干细胞的作用。这种干细胞具有自我更新和无限增生的潜能,在启动肿瘤形成和生长中起着决定性的作用,是肿瘤转移、复发及耐药的根源。能发生肿瘤的结肠癌干细胞的鉴别对结肠癌预防和治疗影响巨大。目前结肠癌的新的有效的治疗策略常常以结肠癌干细胞作为治疗靶点。针对结肠癌干细胞的治疗靶点一般包括功能性表面标志分子、结肠癌干细胞的信号通路、干细胞对称分裂和干细胞龛等,而其中以表面标志分子最为重要。CD133是近年来在肿瘤干细胞领域研究较为活跃的细胞膜糖蛋白之一,首先在脑瘤和前列腺癌中被发现,肿瘤组织中只有表面含有CD133蛋白的特定细胞才能产生新的肿瘤,也就是说这些表面含有CD133蛋白的细胞才是肿瘤干细胞。然而,随着研究的深入,文献报道出现不一致的结果。原先认为脑肿瘤干细胞表达CD133,而Beier等发现不同亚型的胶质瘤的肿瘤干细胞生物学特性不一样,其中培养形成悬浮的微球体的脑肿瘤干细胞表达CD133⁺,而培养形成贴壁的微球体的脑肿瘤干细胞不表达CD133,还有的培养不能形成微球体,且不表达CD133。在人结肠癌干细胞中的研究亦是如此,Ricci-vitiani等和O’Brien等在2007年分别用CD133作为干细胞标记物对结直肠癌细胞进行了研究,证明结直肠癌中存在CDl33⁺细胞,这部分细胞表现出干细胞特性。Shmelkov等利用不同方法分析CD133基因的表达情况,发现CD133不仅在结肠癌干细胞中表达,在结肠正常上皮组织和结肠癌组织中均表达,质疑作为CD133作为结肠癌干细胞标志的可能性,CD133在结肠肿瘤和正常组织中表达的意义还不明确。事实上,前一个研究结果是基于使用AC133单克隆抗体流式检测细胞表面CD133表达,而后一个结果是使用基因敲出动物模型来分析,lacZ报告基因提示基因的转录存在转录后调节,不能有效反应相应蛋白的表达和功能。因此,我们认为CD133可能在维持结肠癌干细胞生物学特性如自我更新和增殖等方面具有重要作用,CD133^-细胞可能是细胞表面CD133蛋白位置的变化如向细胞内转位,或存在转录后修饰,导致其糖基化抗原决定簇发生改变而不能检测到,而并不是CD133蛋白的真正丢失。本研究拟在以CD44和EpCAM两种表面标志物分离、鉴定人结肠癌干细胞后,构建并包装可表达CD133基因特异性siRNA的慢病毒载体病毒颗粒,通过载体病毒感染后表达siRNA阻断结肠癌干细胞内CD133基因的表达,观察结肠癌干细胞生物学特性的变化,以期初步了解CD133基因表达、活化对结肠癌干细胞“干性”的影响。方法与结果1.分离并鉴定CD44⁺ EpCAM^high结肠癌干细胞:从人原代结肠腺癌中分离、纯化CD44⁺ EpCAM^high结肠癌干细胞,结肠癌原代细胞中CD44⁺ EpCAM^high细胞比例为1.7%³8%（平均5.4%）。单克隆形成实验证实结肠癌组织中存在肿瘤干细胞,其比例为（2.07±0.11）%,分离获得的CD44⁺ EpCAM^high细胞能在无血清培养基中“成球”,在血清诱导下能贴壁分化;将CD44⁺ EpCAM^high细胞移植在Balb/C裸鼠体内,表现出很强的致瘤性,移植瘤中CD44⁺ EpCAM^high细胞比例为3.6%⁴3.2%（平均15.2%）,所有的移植瘤经组织学测定,均形成腺管样结构,表达结肠特异性分化标志物CK-20、中性上皮粘蛋白（neutral epithelial mucins,Muc）.2.制备CD133 siRNA慢病毒载体:设计三条CD133 siRNA干扰序列,成功构建CD133/shRNA重组质粒,PCR鉴定阳性克隆,并测序;将pGC-CD133质粒、pHelper1.0质粒、pHelper2.0质粒共转染293T包装细胞,采用逐孔稀释法测定病毒滴度为1E+8 TU/ml,并在荧光纤维镜下可见细胞内大小不等的绿色荧光颗粒;从CD44⁺ EpCAM^high结肠癌干细胞中分离CD133⁺细胞,在目的细胞中采用实时荧光定量PCR筛选有效的CD133 siRNA干扰序列,siRNA-CD133^-1、siRNA-CD133^-2、siRNA-CD133^-3转染的细胞中CD133 mRNA分别下调了87.7%、39.2%和67.3%,与对照组和阴性转染组有明显差异（P<0.05）。Western blot测定pGC-CD133对CD133⁺结肠癌干细胞CD133蛋白表达的抑制作用,结果显示siRNA-CD133明显抑制CD133蛋白水平的表达,转染siRNA组与对照组Control组和NC组之间有显著性差异（P<0.05）,但Control组与NC组的CD133蛋白表达无明显差异（P>0.05）,其中以siRNA-CD133^-1转染细胞中的下调最为明显。3.观察CD133⁺结肠癌干细胞感染pGC-CD133后的生物学特性的变化:流式分选CD44⁺ EpCAM^high结肠癌干细胞,发现其中CD133⁺细胞比例为89.2%。实验组经过LV-CD133shRNA载体病毒感染后,在荧光显微镜下观察可见绿色荧光蛋白表达,但在干细胞养液中细胞改悬浮生长的方式为贴壁生长,不能形成细胞球。CD133⁺细胞在LV-CD133shRNA载体病毒感染后,MTT法测定发现细胞增殖减慢,克隆形成率明显下降。将感染细胞移植在Balb/C裸鼠体内,在观察期间,感染LV-CD133shRNA载体病毒的CD133⁺细胞无肿瘤形成,而在感染LV-shRNA载体病毒的CD133⁺细胞,与未分选的EpCAM^high CD44⁺结肠癌干细胞相比,成瘤率下降,成瘤时间较前延长。运用RT-PCR分析慢病毒转染后CD133⁺结肠癌干细胞中ABCG2基因mRNA表达情况,结果发现:LV-CD133shRNA感染CD133⁺细胞后,ABCG2 mRNA表达水平与LV-shRNA感染组和空白对照组相比明显降低（P<0.01）,而LV-shRNA感染组和空白对照组相比无明显差异（P>0.05）。从CD44⁺ EpCAM^high结肠癌干细胞中流式分选获得CD133—细胞,Western blot分析其中CD133蛋白表达情况,结果显示CD44⁺ EpCAM^high结肠癌干细胞中CD133^-细胞也有CD133蛋白的表达。结论1.人结肠腺癌组织中存在结肠癌干细胞,这些细胞以CD44⁺ EpCAM^high作为其表面标志,具有明显的干细胞特征和很强的致瘤性,能在无血清培养基中成球生长。2.利用慢病毒siRNA表达载体pGCsi-U6/Neo/GFP质粒成功构建、包装CD133基因特异性siRNA表达载体病毒,对人结肠癌干细胞具有很高的感染效率,感染结肠癌干细胞后可显著的抑制细胞CD133蛋白表达和活化.3.结肠癌干细胞在CD133基因表达和活化被阻断后,细胞生长方式发生变化,增殖速度下降,克隆形成率降低,成瘤能力显著下降,ABCG2表达明显下降。4.从CD44⁺ EpCAM^high结肠癌干细胞中分选的CD133—细胞也有CD133蛋白的表达。