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疼痛是一种与实际或潜在组织损伤相关联的不愉快的感觉和情感体验,是一种复杂的生理心理活动,是临床上最常见的症状之一,也是促使人们就医的最常见原因之一。慢性疼痛不仅仅是一种症状,也可以是一种疾病。任何人一生中都难免要遭受疼痛的折磨。全世界有三分之一以上的人正在不同程度地遭受着慢性疼痛的折磨,严重影响了工作、学习和生活。疼痛不会导致直接患者死亡,但有些患者因为忍受不了长时间的严重慢性疼痛而产生自杀的念头,甚至采取自杀行为。麻醉性镇痛药和非甾体消炎镇痛药仍然是目前疼痛治疗的最主要药物,但这些药物特异性不高,疗效并不理想,而且长期使用可以引起药物依赖、呼吸抑制、胃肠道损伤等严重副作用,相当一部分病人不得不停止使用。顽固性癌痛和神经病理性疼痛的治疗是临床医师面临的棘手课题,神经病理性疼痛一般对阿片类药物不敏感,抗抑郁药和抗癫痫药治疗神经病理学疼痛的疗效不佳。因此,国内外不少学者在不断地探究疼痛产生的病理生理机制,寻求疼痛治疗的新技术和新方法。转录因子下游调控元件的拮抗分子(Downstream regulatoryelement antagonist modulator,DREAM)是痛觉处理过程中关键的转录抑制子之一,DREAM与前脑啡肽原基因(preprodynorphin,PPD)的DRE(Downstream regulatory element)位点结合,抑制PPD基因表达而发挥作用。DREAM痛觉调节作用的发现为疼痛治疗提供了崭新的研究靶点,我们可以通过阻断DREAM基因,解除其对PPD基因表达抑制,激活内源性强啡肽/κ受体镇痛系统,发挥镇痛作用。RNA干扰(RNA interference,RNAi)现象的发现和RNA干扰技术的不断完善,RNAi已经成为当今生命科学研究领域的研究热点之一。RNAi具有高度特异性和高效性,并有强大的细胞穿透能力,可在细胞间传递,甚至遗传给子代等特点。RNA干扰是研究生物体基因表达、调控与功能的新技术,是一种快捷高效、特异性强的抑制基因表达的工具。近年来有人将RNAi技术用于疼痛治疗实验研究取得成功。如2004年Dorn等将他们将化学合成的针对P2X3的小干扰RNA(small interfering RNA,siRNA)经鞘内注入,显著减轻了大鼠神经病理性疼痛,不伴有明显的毒性反应和非特异性反应。提示RNAi技术用于疼痛的基因治疗是可行的。本研究的目的是利用RNA干扰技术抑制DREAM基因表达,开展对神经病理性疼痛基因治疗的实验研究。整个研究分三部分进行,第一部分观察设计的针对DREAM基因的SiRNA在神经胶质细胞中的RNA干扰效应,确定针对DREAM基因进行RNA干扰的有效作用位点,为后续的慢病毒载体的构建及体内实验奠定基础。利用在线网站的生物软件设计多个DREAM基因的RNA干扰序列,构建RNA干扰质粒,然后利用脂质体转染到神经胶质细胞中,通过荧光显微镜观察、Realtime-PCR测定DREAM基因的mRNA含量、Western Blot测定DREAM蛋白含量以观察RNA干扰效应。结果显示针对示针对DREAM基因设计了3条SiDREAM序列并构建了siRNA表达载体在培养的神经胶质细胞中转染率为85%,其中siRNA表达载体pRNAT-DREAM-Ⅱ和pRNAT-DREAM-Ⅲ使DREAM基因mRNA分别下调59%和47%,DREAM蛋白的表达亦明显降低。第二部分是针对DREAM基因有效的RNA干扰作用位点构建能够在细胞内表达siRNA的慢病毒载体。根据第一部分实验筛选出的有效的siRNA序列设计合成适当的引物,重组到慢病毒穿梭质粒中,将重组质粒pKCSHR-puro/GFP-DREAM和慢病毒包装系统共转染293T细胞包装出复制缺陷的慢病毒颗粒,并进行载体病毒滴度的测定。结果成功构建了慢病毒质粒pKCSHR-puro/GFP-DREAM,测序结果与设计的siRNA序列完全一致,将质粒pKCSHR-puro/GFP-DREAM与慢病毒包装系统共转染293T细胞获得滴度为1.0×10~8 ifu/ml慢病毒颗粒。第三部分是将携带有siDREAM的慢病毒颗粒注入大鼠体内,研究siDREAM的RNA干扰效应,为以后临床实验奠定基础。将纯种健康清洁级成年雄性SD大鼠36只,随机分为6组:正常对照组(N)、假手术组(S),根据干预手段的不同将CCI疼痛模型组分为4组:CCI组(CO组),CCI疼痛模型建立后不给任何干预措施,观察术后3d、7d、10d、14d、21d的疼痛行为学的改变。生理盐水对照组(C1组),空白载体对照组(C2组),pKCSHR-puro/GFP-DREAM治疗组(C3组)。该三组大鼠于CCI后第7天分别于蛛网膜下腔注射生理盐水、空白载体、pKCSHR-puro/GFP-DREAM病毒载体,观察各组术后3d、7d、10d、14d、21d的疼痛行为学的改变。实验结束取腰段脊髓进行荧光显微镜检测GFP(绿色荧光蛋白)的表达,Realtime-PCR测定DREAM基因的mRNA含量、Western Blot测定DREAM蛋白含量以观察RNA干扰效应。结果发现鞘内注射pKCSHR-Puro/GFP-DREAM慢病毒载体后,CCI大鼠热痛阈和机械痛阈的异常明显得到改善,腰段脊髓神经细胞DREAM基因mRNA和DREAM蛋白的表达均显著降低(P＜0.05)。本研究所得到的结论如下:1.成功构建了针对DREAM基因特异性siRNA表达载体,在体外培养的神经胶质细胞中产生针对DREAM基因特异性的RNA干扰效应,并确定了最佳作用位点为536～555。2.成功构建了表达siDREAM的慢病毒质粒载体—pKCSHR-Puro/GFP-DREAM,并与慢病毒包装系统共转染293T细胞,获得了滴度高达1.0×10~8 ifu/ml慢病毒颗粒。3.鞘内注射pKCSHR-Puro/GFP-DREAM慢病毒颗粒可高效转染到大鼠脊髓神经细胞内,能够有效改善CCI大鼠痛觉异常,初步证实具有镇痛效应,为疼痛的基因治疗提供了新的思路。4.鞘内注射pKCSHR-Puro/GFP-DREAM慢病毒颗粒可使大鼠腰段脊髓内DREAM基因mRNA表达下调,DREAM蛋白表达降低,提示pKCSHR-Puro/GFP-DREAM慢病毒颗粒在大鼠活体内发挥了RNA干扰作用。