铁是植物生长发育所必需的微量元素,在植物体的生理代谢过程中发挥着极为重要的作用。虽然铁在地壳中含量丰富,但生物利用度却非常低。植物缺铁会严重影响作物的产量和质量,因此植物缺铁黄化已成为世界性营养失调问题。通过研究植物对土壤中铁的活化、吸收、代谢以及积累的生理及分子机制,人们可以用现代生物学手段改变植物铁的吸收和积累模式,培育铁高效农作物新品种,增加农作物产量,改善人类铁营养状况。为了提高植物的铁成分,本实验室将大豆铁蛋白基因导入了烟草叶绿体基因组中,转化体的铁蛋白表达量达到了总可溶蛋白的15%,但转基因植物的铁含量仅比对照植物提高了2-3倍,而且出现了叶片黄化等表型。为了进一步研究机理I植物铁代谢机制,本研究分别在野生型烟草和铁蛋白叶绿体转基因烟草中过表达铁螯合物还原酶基因AtFRO6和AtFRO2,通过分析转基因植株生理功能的变化,进一步明确铁螯合物还原酶在植物铁代谢中的作用,加深对植物铁代谢分子机理的理解。主要研究结果如下:1.利用RT-PCR技术分别克隆得到了拟南芥FRO6基因和FRO2基因全长cDNA,构建了由启动子CaMV35S调控的FRO6基因的植物表达载体pBI121 FRO6,由启动子CaMV35S调控的FRO2和FRO6基因的植物表达载体pCAMFRO2FRO6。2.采用农杆菌介导转化方法,将FRO6基因导入野生型烟草及铁蛋白叶绿体转基因烟草细胞核基因组中。通过PCR、Southern blot检测、Northern blot检测,证明FRO6基因已导入两种受体烟草中并大量表达,共获得18株转FRO6野生型烟草(6WT)和18株转FRO6铁蛋白叶绿体转基因烟草(6Fe)。3.采用农杆菌介导转化方法,将FRO2基因和FRO6基因共同导入野生型烟草及铁蛋白叶绿体转基因烟草细胞核基因组中。通过PCR、Southern blot检测、Northern blot检测,证明FRO2基因和FRO6基因已同时导入两种受体烟草中并大量表达,共获得14株同时转FRO2和FRO6野生型烟草(8WT)和15株同时转FRO2和FRO6铁蛋白叶绿体转基因烟草(8Fe)。4.转FRO6野生型烟草(6WT)和转FRO6铁蛋白叶绿体转基因烟草(6Fe)生理功能分析显示,无论是在铁充足还是缺铁情况下,转基因植株叶片铁螯合物还原酶活性、叶片亚铁含量以及叶绿素含量明显高于对照植株;在铁充足但不添加蔗糖情况下,转基因植株叶绿素含量明显高于对照植株。无论是在铁充足还是缺铁情况下,转基因植株根铁螯合物还原酶活性、根亚铁含量、叶片总铁含量以及根总铁含量与对照植株相比无显著差异。5.对转FRO2FRO6野生型烟草(8WT)和转FRO2FRO6铁蛋白叶绿体转基因烟草(8Fe)的生理功能进行了分析。结果表明,无论在铁充足还是铁缺乏情况下,转基因植株叶片铁螯合物还原酶活性、叶片亚铁含量以及叶绿素含量明显高于对照植株;在缺铁情况下,转基因植株根铁螯合物还原酶活性、根亚铁含量、根总铁含量以及叶片总铁含量与对照植株相比有显著提高;而在铁充足情况下,转基因植株根铁螯合物还原酶活性、根亚铁含量、根总铁含量以及叶片总铁含量与对照植株相比无显著差异;在铁充足但不添加蔗糖情况下,转基因植株叶绿素含量明显高于对照植株。6.研究表明,AtFRO6具有铁螯合物还原酶活性,主要在叶细胞吸收铁的过程中发挥作用。AtFRO6表达不受缺铁诱导,可能是转录后水平调控。过表达FRO6可以提高叶细胞吸收铁的能力,增加叶片中亚铁和叶绿素含量,增强光合作用,进而改善植株铁营养状况,增强植株耐低铁能力。7.同转AtFRO2和AtFRO6基因的烟草生理数据显示,在铁缺乏时,既增加了转基因植株的根铁螯合物还原酶活性,也增加了叶片铁螯合物还原酶活性,而单独转AtFRO6基因只能增加叶片铁螯合物还原酶活性,且增加的量没有同时转FRO2FRO6高,因此FRO2FRO6多基因转化对改良作物耐缺铁能力有重要意义。8.在导入FRO6或FRO2FRO6后,铁蛋白叶绿体转基因烟草的黄化表型均得到一定程度的改善。我们推测,铁蛋白叶绿体转基因烟草黄化的原因可能是铁蛋白在叶绿体中大量积累导致了不合理的铁储存,扰乱了叶绿体的铁稳态,致使可供植物进行生理反应的自由铁减少,因此植物出现了黄化表型。过表达AtFRO6提高植物叶片吸收铁能力,过表达AtFRO6和AtFRO2既提高了叶片吸收铁能力,也提高了根吸收铁能力,因此转基因植株6Fe和8Fe在一定程度上缓解了这种铁稳态平衡的改变。