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目的:心衰是导致多数心脏病人死亡的最终发展阶段,严重影响了患者的生命健康。因此,如何在心衰发病的早期及时诊断、指导临床医生尽早开展抗心衰的治疗一直是人们研究的热点。研究发现:N端前脑钠肽(NT-pro BNP)是判定心衰进程、发展的主要标志物,其含量变化可敏感及特异地反应心室功能的变化和心脏功能的损伤及损伤程度。目前国内关于NT-pro BNP检测产品技术的研究处于起步阶段,所需抗体等主要材料大多依赖进口。因此,本研究拟通过制备抗NT-pro BNP单克隆抗体、并以此为基础建立一种检测人血清中N端前脑钠肽含量的双抗体夹心ELISA检测方法来推动国内该疾病检测方法的进步。方法:1.将NT-pro BNP抗原免疫BABL/c小鼠,经细胞融合、阳性细胞株筛选制备NT-pro BNP单克隆抗体。用分别与OVA耦联的线性表位片段18~38、35~50、55~72筛选确定所得单抗针对的线性表位,并通过间接ELISA特异性分析及亚型分析方法对所得单抗进行特异性及亚型鉴定。2.通过双抗体夹心ELISA法对所得单抗筛选获取配对单抗,并以此为基础通过包被与封闭条件、包被与酶标抗体工作浓度、反应模式、室内质控品及标准品的建立、线性范围、批内、批间精密性、回收率、干扰因素等方面的研究,建立人N端前脑钠肽ELISA定量检测方法。结果:1.共获得15株单克隆抗体。单抗亚型及表位鉴定显示:10株为Ig G1亚型,这10株中有5株针对18~38线性表位,2株抗体针对35~50线性表位,3株抗体针对55~72线性表位,且与心衰相关标志物均无交叉反应。其中,5E10和5G5抗体配对。另外5株不是针对特异性表位抗原的单克隆抗体,舍弃。2.本实验建立的双抗体夹心ELISA检测方法的条件为:包被抗体浓度为4μg/m L,酶标稀释倍数为1:3 000;反应模式为两步法反应模式:37℃样本孵育30 min,酶标孵育30 min,显色20 min。3.建立的NT-pro BNP检测方法:线性范围为50~500 pg/m L,批内及批间精密性分别为2.3%和3.4%。低值、中值及高值的回收率分别为93.7%、97.2%、101.2%。干扰因子脂血、黄疸及低浓度溶血等对试验结果无影响。用200份临床血清测试,该试剂临床总符合率为96.9%,用48份与国外试剂盒平行测试,结果表明两者具有相关性,回归方程:Y=0.8017X+188.3,R2=0.9027。结论:1.利用单抗制备技术成功制备出10株NT-pro BNP单抗,并筛选出1对最优的NT-pro BNP检测用配对单抗。2.初步建立了一种用于人血清中N端前脑钠肽含量检测的ELISA方法,该方法具有较高的特异性和精密性。可初步应用于临床对NT-pro BNP的检测,为心衰的早期诊断提供了帮助。