论文部分内容阅读
脑肿瘤是严重威胁人类健康和生命的疾病,神经胶质瘤又是颅内最常见的恶性肿瘤。胶质瘤有向正常脑组织中侵润性生长的特性,尤其在脑重要功能区及附近时,无法将肿瘤完全切除,术后易复发。放疗、化疗虽可杀伤肿瘤细胞,但同时亦会损伤部分正常脑组织,并可能会出现严重的全身不良反应。近来许多学者将荧光光谱学技术用于肿瘤检测,利用自体荧光或药物荧光的检测方法,可以发现肉眼难以察觉或辨认的微小病变,从而显著提高癌前病变和微小癌的检出率。光动力诊断(Photodynamic Diagnosis,PDD)是一种通过以特定波长的光照射一定的光敏物质后产生的一系列化学、物理、生物等反应以诊断肿瘤的方法,即输入外源性光敏剂一定时间后,这些光敏物质可以较高的浓度存留在肿瘤组织或肿瘤细胞中,从而与肿瘤周围的正常器官组织形成浓度差,这时如以特定波长的光照射肿瘤部位,就可能激发出特殊形状和强度的光谱图,或在荧光手术显微镜下显色可提示该处可能有肿瘤存在。而光动力治疗(Photodynamic Therapy,PDT)则是利用光敏剂和激光活化进行疾病治疗的新方法,其基本原理是肿瘤组织可选择性吸收光敏剂,并在一定时间内肿瘤组织中光敏剂的含量较正常组织多出数10倍,此时用特定波长的光源照射肿瘤部位,活化光敏剂,产生光化学反应,损伤多种细胞靶点,破坏肿瘤组织,从而达到选择性治疗肿瘤目的。5-氨基乙酰丙酸(5-Aminolevulinic acid,5-ALA)是一种活化光敏剂。研究发现,ALA-PDD或ALA-PDT相对于普通的诊断治疗方法,能明显提高脑肿瘤诊断治疗效果,但联合ALA-PDD和ALA-PDT效果如何?目前尚没有定论。探讨二者联合运用对脑肿瘤的诊治效果,将有可能为临床诊治脑肿瘤提供新的思路。另一方面,以往对ALA-PDT抗肿瘤作用机制的研究主要集中在诱导凋亡和坏死等方面;随着对自噬研究的不断深入,自噬在肿瘤发生、发展以及消亡中的作用越来越受到重视。自噬与凋亡共享着一些调控因子,关系密切;在ALA-PDT的基础研究和临床应用中充分认识并且合理协调利用自噬与凋亡抗肿瘤的积极因素,调动肿瘤细胞自身死亡机制,将有助于推动肿瘤光动力治疗研究及其相关学科的共同发展。为了探讨ALA光动力诊断与光动力治疗脑肿瘤的疗效及机制,我们首先制备了兔脑VX2转移瘤模型,分别给予PDD导向显微手术和(或)PDT后观察实验动物的生存期、MRI影像及病理学表现,探讨光敏剂ALA应用于兔脑VX2转移瘤的诊断及治疗效果;然后体外建立大鼠C6胶质瘤细胞模型,观察不同ALA浓度及不同孵育时间PDT对C6胶质瘤细胞存活率的影响,应用TUNEL法测定细胞凋亡率,并通过MDC染色和电镜等观察ALA-PDT后的自噬现象,探讨自噬与凋亡机制在ALA-PDT诱导C6胶质瘤细胞死亡中的作用;最后,我们分别使用自噬抑制剂3-MA和凋亡抑制剂z-VAD-fmk干预后,观察ALA-PDT诱导C6胶质瘤细胞存活率的变化,并检测溶酶体酶cathepsin B蛋白表达和Caspase-3活化,以探讨自噬与凋亡机制在ALA-PDT诱导C6胶质瘤细胞死亡中的作用机制。主要实验结果如下:1.各实验组(普通光源显微手术组、PDT组、PDD组、PDD导向显微手术+PDT组)平均生存期均较荷瘤对照组明显延长(P<0.01),而PDD导向显微手术+PDT组荷瘤兔生存期显著长于PDD组(P<0.05)。MRI结果显示PDD导向显微手术、PDD导向显微手术+PDT组较普通光源显微手术组能更彻底切除肿瘤。组织学检查结果显示肿瘤荧光强度较高的区域肿瘤细胞多;荧光微弱的区域散在分布有少许肿瘤细胞,其核分裂像及细胞密度明显降低或接近正常组织,少见异常的血管内皮增生。肿瘤周边区域未见肿瘤细胞;坏死的肿瘤区域没有激发荧光。尸检病理检查提示各手术治疗组肿瘤在原术腔不同程度的复发,复发率分别为:普通光源显微手术组50%(5/10例),PDD组25%(5/20例);PDD+PDT组15%(3/20例)。2.经5-ALA介导的光动力治疗后,C6胶质瘤细胞的存活率随5-ALA的浓度递增逐渐下降,各组之间及各实验组与对照组间均有显著差异,当浓度为400ug/ml时细胞存活率少于50%。不同5-ALA孵育时间的细胞存活率存在显著差异,5-ALA孵育时间为6 h之前,细胞存活率随着孵育时间的延长而下降;超过6 h后细胞存活率无显著变化。TUNEL法测定100μg/ ml、200μg/ ml及400μg/ ml 5-ALA组C6胶质瘤细胞凋亡率分别为21%、49%、62%。3. ALA-PDT后3 h,MDC染色C6胶质瘤细胞内可见明显的点状荧光颗粒,且随时间逐渐明显增多,24h时荧光颗粒变弱,而对照组则无此现象。提示ALA-PDT 3 h时开始出现自噬囊泡,C6胶质瘤细胞发生自噬;而PDT后12 h,细胞内自噬囊泡数目大量增多,自噬明显活化。透射电镜观察到ALA-PDT后3 h时,胞浆中即出现大量独立双层膜结构,12 h时自噬体及其独立双层膜结构相对变少,24 h时观察到典型的凋亡形态,同时仍可见较多的自噬体和独立双层膜结构,及自噬溶酶体的出现。在整个观察中,未见细胞肿胀等坏死形态特征的出现。4.凋亡抑制剂z-VAD-fmk能减弱ALA-PDT对C6胶质瘤细胞的生长抑制作用(P<0.05);自噬抑制剂3-MA预处理组C6胶质瘤细胞生存率显著增加(P<0.05);联合运用z-VAD-fmk和3-MA时,C6胶质瘤细胞死亡率明显降低(P<0.05)。5.激光共聚焦显微镜观察到PDT后1 h时,C6胶质瘤细胞胞浆内游离Ca2+荧光强度很弱,此后逐渐增强,6 h时达最强,12 h后开始下降;对照组C6胶质瘤细胞内Ca2+荧光微弱;流式细胞仪检测到ALA-PDT后细胞内钙荧光强度值明显升高。于荧光强度最明显的20 min和6 h给予3-MA干扰后,细胞内平均钙荧光强度值均明显降低,呈显著差异。免疫荧光反应观察到ALA-PDT后1 h即可见LC3荧光分布持续至给药24 h时。6. Western-blot结果提示ALA-PDT 1 h时,C6细胞cathepsin B蛋白明显增加,12 h时达峰值;3-MA干预后cathepsin B表达降低。ALA-PDT后1 h C6胶质瘤细胞内少量Caspase-3活化,12 h时Caspase-3酶原表达最高;Ac-DEVD-CHO干预后Caspase-3酶原活化明显减弱。我们通过观察5-ALA介导PDD和(或)PDT治疗兔脑VX2肿瘤效果,发现手术治疗和单次PDT均能延长VX2荷瘤兔的生存期,显微手术与PDT等其它疗法相结合后治疗效果增强;PDD导向显微手术联合PDT可快速而高效治疗脑转移瘤。通过观察自噬与凋亡在PDT诱导C6胶质瘤死亡作用的影响,并探讨其机制,明确了ALA-PDT对体外培养大鼠C6胶质瘤细胞有明确杀伤效应,且这种杀伤效应与5-ALA浓度、ALA与细胞孵育时间呈正相关;ALA-PDT诱导C6胶质瘤细胞自噬与凋亡处于动态变化中,早期自噬性保护作用可延迟凋亡的发生,ALA-PDT诱导C6胶质瘤细胞自噬的发生最终有利于抑瘤作用的发挥;在体外条件下3-MA可能通过抑制胞内游离钙的升高而削弱ALA-PDT诱导的细胞自噬,ALA-PDT可诱导胞内游离钙升高,这可能与C6胶质瘤细胞发生自噬有关。为临床ALA-PDT治疗脑胶质瘤提供了实验依据。