目的:肺癌是世界范围内发病率和死亡率最高也是增长最迅速的恶性肿瘤之一。因此找寻到有效的生物学标志进行早期发现、诊断、治疗及预后评估具有重要意义。19号染色体长臂1区3带3亚带19q13.3一直被认为是肺癌易感区域,GWAS和流行病学研究表明19q13.3基因的遗传多态和基因表达与肺癌的发生发展和预后结局密切相关。此区域中主要包含3个重要基因分别为ERCC1、CD3EAP和PPP1R13L,它们分别在细胞DNA损伤修复,细胞增殖和细胞调亡等方面发挥重要作用,在以肺癌为代表的肿瘤的发病和进展中起着重要作用。近年来,非编码RNA因为其重要的生物学功能逐渐成为肿瘤研究的热点。我们以往的研究发现位于19q13.3区域的ERCC1基因主要受到miRNA的转录后调控,与肺癌的发生发展密切相关。而非编码RNA家族中另一类重要成员:环状RNA（CircRNA）因为其在组织和细胞中良好的稳定性、组织特异性和重要的肿瘤生物学功能成为肿瘤生物标志物研究的热点之一。目前已经发现一些circRNAs能够作为影响肿瘤发生发展的生物标志物受到人们广泛关注。而作为肺癌易感性区域的19q13.3是否能够产生circRNAs,这些circRNAs是否与肺癌发生发展相关、及其作用机制并且能否作为良好的生物标志物至今尚无报道。本研究首先通过生物信息学筛选19q13.3区域产生的circRNAs,检测其是否在肺癌细胞、组织中表达,分析其与肺癌临床指标的关联。发现circRNA hsa_circ₀051488在肺鳞癌组织和细胞中低表达且与肺鳞癌患者不良的临床指标相关,可能具有重要的生物学功能和作为潜在的生物标志物的价值。因此,为了进一步探索hsa_circ₀051488表达是否与肺鳞癌的恶性程度相关,阐明hsa_circ₀051488通过何种机制影响肺癌生物学特性而影响肺癌的发生发展,进而为源于19q13.3的circRNA hsa_circ₀051488作为预测肺癌的发生发展的生物学标志提供科学证据。研究方法:首先,根据circRNA数据库（circBase）筛选染色体19q13.3区域产生的circRNAs,根据这些circRNAs在肺癌细胞A549中的表达,筛选出一个在A549中高表达的circRNA hsa_circ₀051488。设计环状RNA特异性跨剪接位点（back-splicing）引物,在正常肺上皮细胞16HBE、肺鳞癌细胞LK₂和A549中检测hsa_circ₀051488表达。通过RNase R水解线性RNA实验,验证hsa_circ₀051488是否能抵抗核酸外切酶的水解作用。其次,本研究从2016年10月至2017年10月,经知情同意,共收集来自中国医科大学第一临床医院初次确诊为肺癌患者的癌及癌旁组织64对,记录患者基本人口学特征、吸烟饮酒情况和肿瘤相关病例信息等。提取RNA并反转录后,qPCR法检测组织中的hsa_circ₀051488的表达,分析hsa_circ₀051488表达在癌组织和癌旁组织的差异。随后分析肿瘤组织中hsa_circ₀05148的表达与患者年龄、吸烟饮酒、肿瘤大小、淋巴结转移和TNM分期之间的关系。再次,使用不同浓度的致癌物BPDE处理16HBE细胞,计算IC₅₀后,根据IC₅₀的结果并结合人群实际暴露情况,使用合适的BPDE浓度诱导16HBE细胞恶性转化。细胞相对增值能力、软琼脂克隆形成及Transwell迁移实验判断细胞恶性程度的变化,裸鼠成瘤实验用于确认转化细胞恶性表型,HE染色和免疫组化确认转化细胞病理类型。在转化过程中及转化后细胞16HBE-T中检测hsa_circ₀051488表达量的变化。16HBE-T和LK₂细胞中转染hsa_circ₀051488过表达质粒,检测其对肿瘤生物学行为的影响。然后,通过核质分离提取RNA后分析hsa_circ₀051488亚细胞定位,判断其可能的功能。通过生物信息学分析预测下游靶microRNAs。通过检测升高或降低hsa_circ₀051488表达时所引起的下游microRNAs变化、双荧光素酶报告实验和肿瘤组织表达量的关联性分析,确认靶microRNA。检测miR-6717-5p表达对16HBE-T和LK₂肿瘤细胞生物学行为的影响。最后,再次通过生物信息学方法,在microRNA靶基因预测网站TargetScan、DIANA和miRwalk严格限制筛选条件,对预测结果取交集后分析miR-6717-5p下游可能的靶基因。通过检测肿瘤组织内靶microRNA和mRNA表达量,分析hsa_circ₀051488、miR-6717-5p和靶基因SATB2三者之间的相关关系。体外转染hsa_circ₀051488过表达质粒和/或miR-6717-5p模拟物,检测对靶基因SATB2的mRNA和蛋白表达的影响,最终确认hsa_circ₀051488具有内源竞争性RNA,即ceRNA功能,吸附miR-6717-5p进而调控靶基因SATB2,在肺癌发生发展中发挥重要作用。结果:1、CircBase数据库筛选19q13.3区域产生的circRNAs,筛选出在A549中表达最高的circRNA hsa_circ₀051488。通过序列比对发现,hsa_circ₀051488是由ERCC1基因（转录本编号:NM₀01983.3）第8和9外显子环化而成。设计特异性的back-splicing引物,qPCR检测发现与16HBE细胞相比,hsa_circ₀051488在A549中表达相对较高,与数据库结果一致,而在LK₂细胞中低表达（P<0.05）。16HBE细胞提取RNA后,用RNase R消化水解线性RNA后,发现GAPDH的mRNA表达量与未消化组相比明显降低,差异显著（P<0.05）,而hsa_circ₀051488表达与未消化组相比并无差别。说明hsa_circ₀051488不易被核酸外切酶降解,具有闭合环化结构,是真实存在的circRNA。提取肺癌患者癌及癌旁组织中的RNA,检测hsa_circ₀051488的表达。结果表明,与配对的癌旁组织相比,hsa_circ₀051488在癌组织中低表达（P<0.05）。进一步分析发现,hsa_circ₀051488的表达在腺癌组织和癌旁无差异,但是在鳞癌组织中低表达（P<0.05）。且鳞癌组织中hsa_circ₀051488低表达与患者较大体积肿瘤（P<0.05）、淋巴结转移阳性（P<0.05）和TNM晚期（P<0.05）相关,与患者年龄、性别、吸烟饮酒情况无关。提示hsa_circ₀051488作为预测肺鳞癌发生发展生物标志物的可能性。2、使用不同浓度BPDE处理16HBE细胞24h,发现BPDE对16HBE细胞的IC₅₀约为2.5μmol/L。根据文献报道并结合人群实际暴露情况,选择浓度为1μmol/L的BPDE致16HBE细胞恶性转化。转化诱导阶段,随着染毒次数的增加,BPDE对染毒细胞的IC₅₀略有升高,即细胞对BPDE的敏感性略有降低。转化过程中,与16HBE细胞相比,转化细胞软琼脂克隆形成能力逐渐加强,Transwell迁移能力逐渐加强,第40代细胞的细胞倍增时间明显缩短（P<0.05）。转化后的细胞16HBE-T能在裸鼠体内成瘤,并且通过对肿瘤组织石蜡切片,HE染色结果提示,转化后的细胞体积较小异常核型明显,为鳞癌分化。免疫组化结果表明,转化后的细胞鳞癌特异性蛋白CK HMW和P40呈强阳性,腺癌特异性蛋白CK LMW和CK-7呈弱阳性或阴性,提示转化细胞倾向于鳞癌。在恶性转化过程中hsa_circ₀051488表达在前20代呈波动状态,后20代逐渐下降。与16HBE细胞相比,16HBE-T细胞中hsa_circ₀051488表达明显下降（P<0.05）,与之前细胞和人群鳞癌组织的结果一致。3、在16HBE-T和LK₂细胞中分别过表达hsa_circ₀051488后,发现hsa_circ₀051488过表达能抑制细胞相对增殖能力（P<0.05）、软琼脂克隆形成能力、迁移能力（P<0.05）和侵袭能力（P<0.05）。核质分离后分别提取RNA并在两种组分中分别检测细胞核RNA标志物U6、细胞质RNA标志物MTRNR1和核质均分布的GAPDH mRNA以及hsa_circ₀051488,发现U6主要分布于细胞核、MTRNR1主要分布于细胞质而GAPDH核质均有分布,说明提取系统良好,可信度高,此条件下发现hsa_circ₀051488主要分布在细胞质中（P<0.05）,因此考虑hsa_circ₀051488具有ceRNA功能,即可能作为microRNA海绵,通过抑制microRNA从而调控下游靶基因发挥作用。通过生物信息学网站miRanda和RNAhybird计算hsa_circ₀051488与microRNAs结合的最小自由能,通过设置自由能<-20 kCal/mol这一条件,初步筛选可能结合的microRNAs。再利用体外转染hsa_circ₀051488过表达质粒和siRNA,改变hsa_circ₀051488表达后检测下游microRNAs表达变化,最终发现miR-6717-5p与hsa_circ₀05148表达变化情况相反,是可能与hsa_circ₀051488结合的microRNA（P<0.05）。在肺鳞癌患者组织中miR-6717-5p和hsa_circ₀051488表达呈负相关（r=-0.681,P<0.05）。双荧光素酶报告基因实验显示,miR-6717-5p能使hsa_circ₀051488报告基因荧光素酶活性下降（P<0.05）,说明miR-6717-5p能与hsa_circ₀051488结合。生物信息预测、体外转染模型、人群样本表达相关性和双荧光素酶报告基因实验四者综合确定hsa_circ₀051488具有ceRNA功能,即作为miR-6717-5p的海绵。为了验证miR-6717-5p的功能,体外转染miR-6717-5p模拟物能使16HBE-T和LK₂细胞的细胞相对增值能力（P<0.05）、软琼脂克隆形成能力、迁移能力（P<0.05）和侵袭能力增强（P<0.05）,但此种增强能在hsa_circ₀051488过表达时被抵消（rescue）,再次验证了hsa_circ₀051488可能作为ceRNA抑制miR-6717-5p的功能。应用生物信息学预测miR-6717-5p的靶基因,对TargetScan（score<-0.2）、DIANA和miRwalk（score>0.9）三个数据库结果初步筛选后取交集并结合文献报道发现肺癌相关基因SATB2是可能的靶基因。在鳞癌组织中,SATB2表达与hsa_circ₀051488表达呈正相关（r=0.542,P<0.05）,与miR-6717-5p表达呈负相关（r=-0.531,P<0.05）。Hsa_circ₀051488过表达时,SATB2在mRNA和蛋白水平都上调（P<0.05）。而miR-6717-5p过表达时,SATB2在mRNA和蛋白水平都下调（P<0.05）,且这种下调能被hsa_circ₀051488过表达所抵消。以上结果更加说明了hsa_circ₀051488作为ceRNA,结合并抑制miR-6717-5p,阻止其对下游靶基因SATB2的抑制作用而发挥生物学功能。结论:1、本研究发现源于肺癌易感区域19q13.3的hsa_circ₀051488,由ERCC1基因第8和9外显子环化而成,在细胞中真实存在。在肺鳞癌组织中低表达,与肿瘤直径更长、淋巴结转移阳性和TNM晚期相关。提示hsa_circ₀051488可能作为一个有价值的预测肺癌发生发展的生物学标志物。2、本研究成功构建了经BPDE诱导的16HBE恶性转化细胞16HBE-T,转化细胞具有肿瘤细胞的性质,且转化细胞病理类型倾向于鳞癌。Hsa_circ₀051488在恶性转化细胞中低表达,与转化的恶性程度相关,提示hsa_circ₀051488与肺癌的发生和发展密切相关。3、本研究通过确定hsa_circ₀051488亚细胞定位、细胞转染模型及鳞癌组织中表达量的相关性,揭示hsa_circ₀051488具有内源竞争性RNA,即ceRNA功能,即吸附miR-6717-5p,作为miR-6717-5p海绵抑制其功能,阻止其对下游靶基因SATB2的抑制作用,进而抑制肿瘤细胞细胞增殖、迁移和侵袭。Hsa_circ₀051488通过影响miR-6717-5p对SATB2的调控作用而影响肺鳞癌细胞的恶性生物学行为,参与肺鳞癌的发生发展。