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经皮腔内冠脉介入(percutaneous coronary inteventional,PCI)是冠心病治疗的重要手段,但因术后损伤反应导致的血管内再狭窄是困扰介入治疗的难题。冠脉内支架植入术的广泛应用使PCI术后再狭窄率明显降低,但支架植入又会引起支架内再狭窄(in-stent restenosis,ISR),其发生率有13%-20%。国内外针对ISR的发生机制对支架进行了多方面改性和改良,目前防治支架内再狭窄的研究热点在于药物洗脱性支架。它可以通过抑制血管内膜的增生降低再狭窄率,但是同时抑制了血管内皮细胞的修复和血管的再内皮化,导致血管内皮的愈合延迟,是迟发血栓形成的主要原因。人们现在普遍认为对支架表面进行细胞修饰可能会加速支架完全再内皮化过程,促进损伤血管愈合,成为解决ISR的一条有效途径。
近来的研究热门之一是把干细胞被作为主要的种子细胞,已有大量文献证实,MSCs参与了血管内膜损伤后的修复,在损伤内膜再内皮化过程中起着重要的作用。在本研究中,我们将采用兔骨髓来源的间充质干细胞(mesenchymal stem cells,MSCs)作为种子细胞,它不仅有着很强的可塑性可以向多种组织和细胞分化,而且取材方便,易于分离、培养、扩增,在体内植入反应弱,在体外连续传代培养和冷冻保存后仍具有多向分化潜能。
本文采用全骨髓贴壁法从新西兰大白兔的骨髓中的分离出MSCs,并在体外进行扩增纯化;选取抗体CD29、CD44、CD34,通过免疫组化、免疫荧光鉴定分离的MSCs;采用超声雾化喷涂装置,在支架表面喷涂均匀的明胶-多聚赖氨酸混合蛋白涂层,扫描电镜检测蛋白涂层在支架上的涂覆情况;利用旋转培养装置,按照前期研究基础确定的最佳旋转培养条件(细胞种植密度为1×105 cells/ml,旋转时间为6 h,旋转速度为0.4 rpm,旋转一次)制作细胞支架,倒置显微镜和扫描电镜检测间充质干细胞在支架表面的粘附及生长情况;以新西兰大白兔为实验对象,于腹主动脉植入间充质干细胞支架,316L不锈钢裸支架、明胶-多聚赖氨酸蛋白涂层支架为对照组。术后1周、4周和12周,处死动物取下置入的支架血管段,扫描电镜鉴定其内皮化效果。
实验研究结果表明:
①使用全骨髓贴壁法从新西兰大白兔体内成功分离出较纯的MSCs,经细胞免疫化学和细胞免疫荧光鉴定,CD29、CD44表达呈阳性,CD34表达呈阴性,说明所分离细胞为CD29+CD44+CD34-细胞。
②采用超声雾化喷涂装置喷涂支架,可以得到涂敷均匀、贴附紧密的明胶-多聚赖氨酸混合蛋白涂层;利用旋转培养装置,按照前期研究基础确定的最佳旋转培养条件(胞种植密度为1×105 cells/ml,旋转时间为6 h,旋转速度为0.4 rpm,旋转一次)制备MSCs修饰的血管内支架,结果显示MSCs完全覆盖于支架表面,呈铺展状,细胞生长状态良好,并且持续生长。
③动物实验检测MSCs修饰的血管内支架,316L不锈钢裸支架、明胶-多聚赖氨酸蛋白涂层支架为对照组,结果显示MSCs修饰的血管内支架在植入动物1个月后就完成了再内皮化过程,极显著的抑制了内膜增生和降低了支架内再狭窄。
本研究在目前修复损伤血管内膜及干细胞治疗修复的研究基础上,将从兔骨髓分离的MSCs种植于血管内支架上,并以动物实验对其内皮化能力检验,探讨了MSCs对损伤血管的再内皮化、重建血管生物学功能治疗内膜损伤性血管性疾病的意义。为进一步的促血管新生治疗、血管新生机制及控制支架内再狭窄的研究奠定基础,同时也为组织工程寻找更有利的更优良的种子细胞。