论文部分内容阅读
放射性脑损伤(radiation injuries，brain；RIB)在临床上常见于原发或继发的头颈部肿瘤放射治疗后，也可由工业生产中放射事故性损伤引发。当RIB一旦形成并产生临床症状时在病程中往往已进入不可逆阶段，不仅严重影响患者生存质量，也给患者的家庭和社会带来沉重负担。目前临床对RIB治疗以脱水剂、激素及对症支持治疗为主，无法从根本上逆转其病情变化，所以寻找有效的治疗方法十分必要。本课题组前期实验已证实碱性成纤维生长因子(basic fibroblast growth factor，bFGF)可抑制辐射诱导的C17.2神经干细胞(neural stem cells，NSCs)凋亡，并对RIB有一定的治疗作用，然而其具体作用机制尚不明确。细胞外信号调节激酶1/2(extracellular signal-regulated kinases1/2，ERK1/2)是丝裂原活化蛋白激酶(mitogen activated protein kinases，MAPKs)的一种，处于多条信号通路的关键环节，且是bFGF与其受体结合后所激活通路的中心环节，对其进行适当调控有望为RIB治疗提供新的思路。本课题拟从离体NSC到活体动物实验，对ERK1/2在bFGF对辐射诱导的NSC凋亡的调控作用及在体RIB的保护作用进行观察，以期进一步明确bFGF治疗RIB的可能机制，为寻找新的治疗靶点提供理论依据。本实验内容分为三部分：
1、ERK1/2参与bFGF抑制辐射诱导的C17.2NSCs凋亡的作用研究；
2、直线加速器全脑分割照射建立放射性脑损伤模型；
3、ERK1/2信号转导通路参与外源性bFGF对放射性脑损伤的保护作用。
研究目的：
观察外源性bFGF对放射诱导的C17.2NSCs凋亡的影响，探讨ERK1/2在bFGF对放射诱导的C17.2NSCs凋亡的抑制效应中的作用。
研究内容：
采用nestin免疫细胞化学染色鉴定C17.2NSCs。MTT法检测外源性bFGF对C17.2 NSCs细胞活性的影响，利用流式细胞仪检测放射后早期凋亡，寻找出有效bFGF浓度后，进一步加入MEK通路的特异性阻断剂U0126，Western blot法检测FGFR1、ERK1/2、p-ERK1/2在C17.2 NSCs的表达。
结果：
1.NSCs培养鉴定：免疫细胞化学染色显示95％NSCs呈Nestin阳性染色；
2.外源性bFGF抑制放射诱导的C17.2NSCs凋亡：流式细胞仪检测结果显示随着bFGF浓度增加细胞凋亡率明显降低，具有剂量-效应关系。bFGF浓度为50ng/ml时已可逆转大部分8Gy射线诱导的细胞凋亡，100ng/ml时对C17.2NSCs凋亡的抑制作用最明显，以100ng/ml作为有效浓度进行下一步实验。
3.ERK1/2在外源性bFGF抑制放射诱导的C17.2NSCs凋亡中的作用研究：加入bFGF培养后，可诱导C17.2NSCs表达FGFR1，且ERK1/2、p-ERK1/2蛋白均呈阳性表达；加入MEK1/2特异性抑制剂U0126后，bFGF诱导细胞表达的FGFR1和ERK1/2蛋白表达水平未受明显影响，p-ERK1/2蛋白表达水平明显减少。
结论：
建模后采用尾静脉直接注射给药法对模型鼠给予外源性bFGF、U0126、DMSO，进行学习记忆能力检测，免疫组织化学染色和Western Blot免疫蛋白印迹方法检测大鼠海马FGFR1、ERK1/2、p-ERK1/2蛋白的表达，HE染色和GFAP、CNPase免疫组织化学染色观察组织病理学改变。
结果：
1.学习记忆能力检测：各处理组与模型组相比，学习记忆能力有显著改善(P<0.01)；U0126组学习记忆能力明显较bFGF治疗组及DMSO组差(P<0.01)，但DMSO组与bFGF治疗组比较则无统计学差异(P>0.05)。
2.FGFR1、ERK1/2、p-ERK1/2检测结果：免疫组化及Western blot检测检测结果显示，模型组大鼠海马有微弱FGFR1、ERK1/2、p-ERK1/2蛋白表达；bFGF治疗组、U0126组及DMSO组大鼠海马内FGFR1、ERK1/2蛋白表达水平相近，无统计学差异(P>0.05)，但均较模型组明显增多(P<0.01)；bFGF治疗组及DMSO组大鼠海马内p-ERK1/2蛋白表达无明显差别(P>0.05)，但较模型组和U0126组明显增大(P<0.01)，U0126组亦显著大于模型组(P<0.01)。
3.组织病理学检测：HE染色显示，组织损伤以模型组最为严重，其次为U0126组，bFGF治疗组与DMSO组相比差异不明显；bFGF治疗组GFAP平均阳性灰度值明显大于模型组(P<0.05)及U0126组(P<0.01)，与DMSO组相比则无明显差异(P>0.05)，且与模型组相比，其它三组GFAP阳性细胞着色深且均匀，突起多、长；bFGF治疗组CNPase平均阳性灰度值明显大于模型组及U0126组(P<0.05)，与DMSO组相比则无明显差异(P>0.05)。
结论：
外源性bFGF经尾静脉注入RIB模型鼠后，可起到一定的治疗作用，并且该治疗作用可能与激活ERK1/2信号转导通路有关。