背景与目的慢性乙型肝炎病毒(Hepatitis B Virus, HBV)感染呈全球分布,全世界范围内大约有4亿患者有血清学证据证实慢性HBV感染。慢性HBV感染潜在的临床终末结局包括肝硬化、肝功能失代偿及原发性肝细胞癌(Hepatocellular Carcinoma, HCC)等,因而临床上如何管理慢性乙型肝炎(Chronic HepatitisB,CHHB)患者是一个严峻的现实问题。目前CHB的临床管理中被广泛接受的治疗目标是持续地抑制HBV复制,并且在HBeAg阳性的患者中取得HBeAg血清学转换,从而在治疗的长远及最终目标中防止出现肝功能失代偿,减缓或阻止病情进展成肝硬化及HCC,延长CHB患者的生存期。其中,长期口服核苷类药物(Nucleo (t)ide Analogs, NUCs)是一个管理CHB患者的有效治疗措施。目前有证据显示基线高病毒载量(High Viral Load, HVL) CHB患者比起低病毒载量CHB患者较不易获得病毒学应答,且HVL与HBV变异发生呈正相关。一项纳入1,006CHB患者,平均随访期为7.7年的研究提示：8.5%的CHB患者最终发展为HCC,而HVL被证实是预测HCC结局的危险因素。为期2年的GLOBE研究证实,在HBeAg阳性CHB患者人群中,基线血清HBV DNA载量<9log10拷贝/mL与ALT水平≥2倍正常上限(ULN)是预测CHB患者替比夫定(Telbivudine, LDT)治疗104周获得良好病毒学应答与血清学应答的有利因素,包括通过敏感的PCR检测仍无法测得CHB患者血清HBV DNA载量及发生HBeAg的血清学转换。然而直到现在,基线高病毒载量慢性HBV感染患者的抗病毒治疗仍然被视为一个临床上的挑战,目前该类患者合适的抗病毒治疗措施仍缺乏有效的循证医学证据。2010版的中国慢性乙型肝炎防治指南建议：基线高病毒载量的CHB患者可选择采用无交叉耐药位点的NUCs类药物初始联合治疗或选用强效高耐药屏障的药物治疗。拉米夫定(Lamivudine, LAM)是首个被用于治疗CHB的口服NUCs,在其多年的临床使用中,被证实能安全且有效地抑制HBV复制。然而,LAM难以在长期抗HBV治疗中取得临床获益,这是因为在LAM的抗病毒选择性压力下,HBV适应性变异获得自然选择。LAM的耐药率为每年14%到32%。LAM耐药发生后,应及时使用无交叉耐药的其他互NUCs进行救援治疗,如阿德福韦酯(Adefovir,ADV)。恩替卡韦(Entecavir, ETV),一个强效高耐药屏障的药物,被大部分临床诊疗指南推荐为一线NUCs药物,包括欧洲肝病协会(European Association for the Study of the Live, EASL) CHB管理指南、美国肝病研究协会(American Association for the Study of Liver Diseases, AASLD) CHB管理指南及亚太肝病协会(Asian Pacific Association for the Study of the Liver, APASL)CHB临床指南。然而,目前仍无循证医学证据证实LAM与ADV初始联合与ETV单药在治疗基线高病毒载量的CHB患者孰优孰劣。因此,本课题通过一个前瞻性、多中心合作、队列研究,旨在证实两种治疗策略在治疗初治高病毒载量HBeAg阳性的CHB患者中是否有任何潜在的抗病毒疗效差异。研究对象与方法一、研究对象截至本稿完成,该项前瞻性、多中心合作、队列研究进行时间为2011年7月至2013年9月。98位年龄介于16-61岁的CHB患者纳入本研究,CHB的诊断标准为HBsAg持续阳性6个月以上。入选患者需满足HBeAg阳性且HBeAb阴性,基线血清HBVDNA为高病毒载量(定义为HBVDNA≥107拷贝/m1)。患者入组治疗前6个月内,有间隔14天以上的两次检测发现血清丙氨酸转氨酶(ALT)升高(>1×ULN),其中,基期入组前要求CHB患者有以下情况将被本研究排除,包括但不限于之前有过NUCs或干扰素(IFN)抗病毒治疗史；患者处于妊娠期或患者酗酒；有明确临床医学证据证实患者有代谢性肝病、自身免疫性肝病、肝硬化、原发性肝细胞癌；血清病毒标志物提示患者合并感染有HCV. HDV或HIV。本项研究已经在世界卫生组织国际临床试验注册平台注册(注册号：ChiCTR-ONRC-12002315)。经南方医科大学南方医院伦理委员会审批,本临床研究已经通过并批准进行(ID：ZHF2011206)。本研究每位入选患者都给予充分知情同意并签署知情同意书。二、实验室检查血清ALT水平通过全自动生化检测仪检测。HBV血清标志物：HBsAg/HBsAb、 HBeAg/HBeAb和HBcAb通过放射免疫测定法检测(雅培试剂检测)。血清HBVDNA载量通过一个实时定量的PCR检测——Cobas Ampliprep/Cobas TaqMan,2.0版(CAP/CTM,罗氏分子系统公司,地址：美国加利福尼亚州普莱森顿)。根据该检测说明书,CAP/CTM的线性范围为20IU/mL至1.7×108IU/mL(1IU/mL=5.82拷贝/mL)。三、患者随访入选患者在四家教学医院之一进行治疗及跟踪随访,四家教学医院分别为南方医科大学附属南方医院,中南大学附属湘雅二院,浙江大学附属邵逸夫医院及第三军医大学附属西南医院。其随访人数分别为45人,19人,14人及20人。血清ALT水平、血清Cr水平、HBV血清标志物及血清HBV DNA病毒载量从基线起每12周检测一次。血清ALT水平、血清Cr水平通过标准操作程序在分中心(中南大学附属湘雅二医院、浙江大学附属邵逸夫医院、第三军医大学附属西南医院)进行检测,HBV血清标志物及血清HBV DNA病毒载量在中心实验室(南方医科大学附属南方医院)进行检测,所有检测程序都严格按照生产商说明书及要求进行。四、疗效及安全性指标本研究主要的疗效指标为达到完全病毒学应答的CHB患者比例,完全病毒学应答定义为HBV DNA<300拷贝/mL (52IU/mL,1.72log10IU/mL)。次要疗效指标包括血清HBV DNA病毒载量的平均下降幅度；获得生化学应答的CHB患者人群比例；获得HBeAg血清学应答的CHB患者人群比例,获得HBsAg血清学应答的患者人群比例；发生原发性无应答、病毒学突破或出现基因耐药的CHB患者人群比例。安全性指标包括入组患者从接受LAM+ADV联合治疗或ETV单药治疗开始出现的药物副作用或实验室检查异常,包括LAM+ADV联合治疗组的血清肌酐水平检测。原发性无应答定义为抗病毒治疗至少24周后,与基线血清HBV DNA载量相比,患者血清HBV DNA载量下降幅度<2log10IU/mL。病毒学突破定义为抗病毒治疗中的CHB患者中,抗病毒治疗已经获得初始病毒学应答,但血清HBV DNA载量经确认证实比最近的一次血清HBV DNA载量≥1log10IU/mL。基因耐药检测定义为CHB患者血清中检测到已经被确认能引起口服NUCs敏感性下降的HBV变异株。五、数据统计本文中连续性变量表达为均数±标准差(SD)形式,分类变量表达为百分数形式。血清HBV DNA载量表达为对数化单位(log10IU/mL)。x2检验和t检验分别用于检测两组数据是否有统计学差异。ROC曲线用来检验预测因子预测预后的相应预测价值。统计学差异定义为P<0.05(双侧检验)。数据分析与质量控制程序为SPSS for windows,版本为13.0。结果一、入组人群一共有120位患者符合入组标准而分别被四个教学医院入组治疗并跟踪随访,其中98位患者完成了48周临床随访。120位患者中最常见的脱落原因有患者的要求(LAM+ADV组9人,ETV组8人),白行停药(LAM+ADV组2人,ETV组1人),计划妊娠或意外妊娠(LAM+ADV组1人,ETV组1人)。由于本研究药物并非免费提供而患者可能考虑到经济层面的负担,选择初始联合LAM+ADV治疗或ETV单药治疗是由临床医生建议,但由患者本人决定。46(46.9%)位患者接受了LAM+ADV初始联合治疗,而剩余52(53.1%)位患者接受了ETV单药治疗。两组患者的性别及年龄等人口学数据未见统计学差异。在基线血清ALT水平(217.9±124.9vs216.1±163.9U/L,P=0.95)和血清HBV DNA载量上(7.88±0.65vs7.91±0.75log10IU/mL,P=0.84)也未见统计学差异,两组患者具有可比性。二、病毒学应答两组患者抗病毒治疗48周的病毒学应答率与24周结果大体上一致。治疗24周时,LAM+ADV组有26.1%(12/46)的CHB患者获得完全病毒学应答,而ETV组有26.9%(25/52)的患者获得完全病毒学应答(P=0.93)。这个趋势持续到了48周,39.1%(18/46)的LAM+ADV组患者获得完全病毒学应答而ETV组这比例为48.1%(25/52),两组患者在病毒学应答率上未出现统计学差异(P=0.37)。对比两组患者平均血清HBV DNA载量下降幅度,LAM+ADV组患者24周血清HBV DNA载量较基线下降幅度为5.36±1.48log10IU/mL,48周血清HBV DNA载量较基线下降幅度为5.69±1.31log10IU/mL,相对比ETV组患者5.27±1.16log10IU/mL(P=0.72)与5.87±1.06log10IU/mL(P=0.45),两组患者在平均血清HBV DNA载量下降幅度上无统计学差异。三、生化学及血清学应答两组患者抗病毒治疗24周和48周的生化学应答未出现统计学差异。治疗24周时,76.1%(35/46)的LAM+ADV组患者与71.2%(37/52)的ETV组患者出现生化学应答(P=0.58)。而在48周时,91.3%(42/46)的LAM+ADV组患者与86.5%(45/52)的ETV组患者出现生化学应答(P=0.46).两组患者的血清学应答率随着治疗时间的延长而逐步提高。在24周时,两组患者HBeAg血清学转换率分别为LAM+ADV联合治疗组6.5%(3/46)与ETV单药治疗组7.7%(4/52),两组差异无统计学意义(P=0.82),48周时两组HBeAg血清学转换率分别为LAM+ADV联合治疗组13.0%(6/46)与ETV单药治疗组11.5%(6/52),两组差异仍未出现统计学意义(P=0.82)。四、原发性无应答、病毒学突破及基因耐药两组患者出现原发性无应答的比例是类似的：在LAM+ADV组有3人出现原发性无应答而在ETV组有1人(6.5%vs1.9%,P=0.25)。然而,我们继续治疗该人群患者并密切跟踪随访,发现以上4位患者都在48周获得了病毒学应答,其血清HBV DNA载量均下降>2log10IU/mL。98位完成48周抗病毒治疗的患者中,有8位患者在48周时经确认证实发生了病毒学突破(LAM+ADV组5位,ETV组3位)。将8位患者进行HBV基因耐药检测发现：1例LAM+ADV组患者出现rtM204V+rtL180M耐药；1例LAM+ADV组患者出现rtA181T/V耐药；ETV组患者未检测出耐药株。综上,LAM+ADV组患者基因耐药率为4.3%(2/46),ETV组为0%,尚未发现统计学差异(P=0.13)。经电话随访,剩余6位患者承认其服用药物不规律,药物依从性不佳,时有忘记服药情况发生。五、抗病毒治疗预测因素HBeAg血清学应答：48周里LAM+ADV组与ETV组共有15人出现HBeAg血清学应答,其基线ALT平均水平为253.89±117.18U/L,相比无HBeAg血清学应答患者(n=83)基线ALT平均水平为210.26±150.12U/L,二者无统计学差异(P-0.29)。早期病毒学应答：两组患者24周出现病毒学应答患者有26人,其基线ALT平均水平为245.79±138.61U/L,相比24周未出现病毒学应答的患者(n=72)基线平均ALT水平206.52±148.32U/L,二者差异无统计学意义(P=0.24)病毒学应答：两组患者48周出现病毒学应答患者有43人,其基线ALT平均水平为259.61±163.14U/L,相比48周未出现病毒学应答的患者(n=55)基线ALT平均水平183.58±122.80U/L,二者差异有统计学意义(P=0.01)。以基线ALT水平对预测CHB患者48周出现病毒学应答进行受试者工作曲线(AUROC curve)分析发现：曲线下面积为0.63(95%CI：0.52-0.75,P=0.025),基线ALT水平预测48周出现病毒学应答有预测价值。当基线ALT≥238U/L(5.95ULN)时,敏感度为51.16%,特异度为78.19%,阳性预测值(PPV)为64.71%,阴性预测值(NPV)为67.19%,阳性似然比(+LR)为2.34,阴性似然比(-LR)为0.62。以基线ALT是否≥5ULN将患者分成两组,高ALT组(n=43)48周病毒学应答率为55.81%(24/43),相比低ALT组34.55%(19/55),差异有统计学意义(P=0.035)。六、药物安全性两组患者都能耐受48周的药物治疗,LAM+ADV与ETV的安全性都被证实良好。在48周期间没有发现有严重的副作用发生。没有病人在治疗期间出现肝炎爆发或肝衰竭。经临床研究者确认,入组患者未出现无肾脏相关性的药物副作用。根据LAM+ADV组血肌酐的变化,没有病例出现血清肌酐>1.2mg/dL。结论1.本研究48周的数据提示LAM+ADV初始联合治疗与ETV单药治疗在初治HBeAg阳性基线高病毒载量的CHB患者人群中病毒学应答率没有统计学差异,LAM+ADV组初始联合与ETV单药治疗都能有效的治疗以上CHB人群。2.基于本研究数据,我们并未发现LAM+ADV组与ETV组在初治HBeAg阳性基线高病毒载量CHB患者人群中血清学应答率有统计学差异,联合治疗并不能带来更高的HBeAg血清学转换。3.基线ALT的水平高低可以一定程度预测基线高HBV DNA病毒载量初治CHB患者抗病毒治疗48周的病毒学应答结果,当ALT≥5.95ULN时,其AUROC为0.63(P=0.025),预测敏感度为51.16%,特异度为78.19%,阳性预测值(PPV)为64.71%,阴性预测值(NPV)为67.19%,阳性似然比(+LR)为2.34,阴性似然比(-LR)为0.62。但其对48周内是否出现血清学应答与24周是否出现早期病毒学应答无预测价值。4.出现原发性无应答与病毒学突破是抗病毒治疗的一个重要事件。在4位出现原发性无应答的患者中,经过继续治疗与密切跟踪随访,所有患者的血清HBV DNA载量在接下来的治疗中得到了控制并下降,其平均下降幅度为3.36±1.05log10IU/mL(范围：2.36到4.78log10IU/mL).基因耐药检测发现LAM+ADV组有2例患者出现基因耐药,分别为rtM204V+rtL180M和rtA181T/V耐药,意味着在基线高HBV DNA载量的患者中,病毒学突破需密切注意及跟踪随访,必要时需要进行基因耐药检测并进行救援治疗,特别是在那些伴随着ALT升高的生化学突破或是使用LAM+ADV联合治疗的患者病例。