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【实验目的】建立体外血管新生模型,研究神经生长因子(NGF)和通心络预处理对骨髓间充质干细胞(MSCs)血管新生作用的影响,并探讨其可能的作用机制。【实验方法】取80g雄性SD大鼠的骨髓,体外分离、扩增、培养MSCs. Matrigel实验建立体外血管新生模型。NGF预处理MSCs:用不同浓度的NGF(Ong/ml,25ng/ml,50ng/ml,100ng/ml, 200ng/ml)处理MSCs 24h,观察MSCs在Matrigel中形成管腔样结构的能力。细胞计数绘制细胞生长曲线比较NGF 50ng/ml处理组MSCs与对照组的细胞增殖能力。应用Western Blot实验检测NGF是否可激活MSCs的PI3K/Akt信号通路,并用LY294002抑制PI3K的激活,及NGF是否可促进MSCs合成内皮细胞生长因子(VEGF)。Matrigel实验检测LY294002是否可阻断PI3K通路,从而检测NGF促进的MSCs血管新生作用是否与激活PI3K/Akt信号通路有关。通心络预处理MSCs:用通心络50ug/ml和100ug/ml处理MSCs 24h,观察MSCs在Matrigel中管腔样结构的形成能力。用划痕实验和Transwell实验检测通心络是否可提高MSCs的迁移能力。用Western Blot实验检测通心络对MSCs合成VEGF、Flk-1、MMP-2、MMP-9和TIMP-2的能力。用明胶酶谱实验检测通心络对MSCs旁分泌pro-MMP-2和活性MMP-2能力的影响。【实验结果】不同浓度的NGF均有促进MSCs在Matrigel中管腔形成的作用,其中NGF 50ng/ml的促进能力最强,此浓度处理组MSCs在Matrigel中形成的管腔长度为对照组的2.24倍(p<0.05)。NGF处理组MSCs的VEGF表达情况与对照组相比没有明显变化。NGF处理组MSCs的细胞增殖能力明显高于对照组MSCs. Western Blot实验显示从预处理1h开始NGF可明显增加MSCs磷酸化Akt的水平,应用PI3K特异性阻断剂LY294002后发现NGF处理组增加的磷酸化Akt水平被逆转。Matrigel实验中LY294002可完全逆转NGF预处理所促进的MSCs管腔形成增加作用。证明NGF对MSCs的促血管新生作用可能与激活PI3K/Akt通路有关。通心络50ug/ml与100ug/ml处理MSCs均可增加其在Matrigel中的管腔样结构的形成能力,通心络100ug/ml处理组MSCs其管腔长度为对照组的3.04倍(p=0.031)。通心络预处理可增加MSCs合成VEGF,但对VEGF的特异性受体Flk-1的表达没有明显影响。划痕实验和Transwell实验均证明通心络可提高MSCs的细胞迁移能力。Western Blot实验证明通心络可促进MSCs合成MMP-2,但MMP-9和MMP-2的活性抑制剂TIMP-2的表达与对照组相比没有显著差异。明胶酶谱实验进一步证明通心络可促进MSCs旁分泌pro-MMP-2和活性MMP-2,这对MSCs的细胞迁移和血管新生起重要作用。[结论]1、NGF和通心络预处理均可提高MSCs体外血管新生的能力；2、NGF对MSCs表达VEGF没有明显影响；3、NGF预处理对MSCs增殖能力的提高和激活PI3K/Akt信号通路等作用可能在NGF对MSCs血管新生的促进过程中发挥重要作用；4、通心络可促进MSCs的迁移能力,并促进MMP-2的旁分泌和VEGF的表达,这与通心络的促MSCs血管新生作用密切相关；5、通心络对MSCs MMP-9和TIMP-2的合成没有明显影响。