随着分子生物学进展特别是人类基因组研究的发展,越来越多的遗传性出血性疾病的分子机制被阐明,这对于深入探讨血小板的病理生理意义以及结构和功能的关系具有重要的意义。基因诊断也成为今后遗传性出血性疾病研究的发展的主要方向。巨大血小板综合征(Bernard-Soulier syndrome,BSS)是一种罕见的先天性遗传性血小板疾病,主要是由于血小板膜糖蛋白GPIb和GPIX质或量的缺陷所致。以出血时间延长、血小板数量减少、血小板体积巨大为特征。血小板无力症(Glanzmann thrombasthenia,GT)是以血小板膜上整合素αIIbβ3的质和(或)量的缺陷为特征的一种常染色体隐性遗传性疾病,表现为血小板对多种生理性诱聚剂反应低下或缺如。先证者通常是因为自幼有不能解释的出血倾向而就诊,这些出血程度表现各异,常被漏诊或误诊,因此,详尽的临床检查和基因检测是正确诊疗的前提。在我们的临床研究中,对上述13例先证者进行表型诊断、基因分析、功能检测和体外细胞实验,以探究其分子发病机制。用血小板聚集仪检测所有先证者不同诱导剂的血小板聚集率;流式细胞术检测患者血小板的GPIbα、GPIbβ、GPIX、GPIIb、GPIIIa的阳性百分率和荧光强度;提取先证者及其家系成员外周血DNA并进行PCR扩增GPIbα、GPIbβ、GPIX、GPⅡb和GPIIIa五种基因全长编码序列,PCR产物直接进行DNA测序分析;构建突变型质粒,用含有野生型或突变型全长编码序列的质粒对中国仓鼠卵巢(CHO)细胞共转染;流式细胞术检测患者共转染CHO细胞的GPIbα、GPIbβ、GPIX、GPIIb与GPIIIa阳性百分率和荧光强度;应用免疫印迹分析转染后CHO细胞胞浆中GPIb-GPIX复合物GPIIb IIIa复合物的表达;进行PCR扩增FLNA基因;免疫荧光法检测FLNA在血小板铺展过程中的表达及分布;Western blot检测FLNA、Sky与Syk-P在静息状态下血小板聚集过程中的表达。结果发现,3例BSS先证者中,血小板对瑞斯托霉素诱导的聚集显著降低(范围,0%-3.5%;平均值1.2%),其中先证者2对低浓度胶原诱导的血小板聚集率明显减少;流式检测显示血小板表面膜糖蛋白GPIbα表达量严重降低(范围,0.5%-7.1%;平均值,3.2%);10例GT先证者中,血小板对ADP诱导的聚集反应明显低下,部分缺失(范围,0%-20.9%,平均值6.1%);流式检测显示血小板表面膜糖蛋白GPIIb IIIa复合物的表达量严重下降:GPIIb(范围,0.1%-98.7%;平均值,19.6%),GPIIIa(范围,0.3%-100%;平均值56.1%)。其中1例GT先证者GPIIb IIIa表达大于50%,然而,血小板与纤维蛋白原的结合能力明显低下,相当于正常对照的14%。通过基因测序,我们共发现有15种突变,其中错义突变8种、无义突变2种和剪切子突变5种。15种突变中,1种突变发生FLNA基因,2种突变发生在IBA基因,2种突变发生在β3基因,10种突变发生在αII b基因。我们对其中的GPIbα基因987G>A,GPIbα基因1480 del A和GPIIIa 719G>A进行了CHO细胞共转染实验,瞬时转染突变型GPIbα987 G>A质粒的CHO细胞膜上GPIbα表达显著减少但在CHO细胞胞浆中发现丰富的截短蛋白;瞬时转染突变型GPIbα1480 del A质粒的CHO细胞膜上未见GPIbα的表达,但GPIX在CHO细胞胞膜上的表达率为阳性对照的18%;稳定转染突变型GPIIIa 719G>A质粒的CHO细胞膜上GPIIb IIIa表达较正常对照差异不显著并大量存在于细胞胞浆中。另外,先证者2 FLNA蛋白在血小板胞浆内的表达量与正常人无显著差别(P<0.01),免疫荧光共定位实验中发现FLNA蛋白能够与GPIIIa共定位,且FLNA蛋白分布正常。在研究低浓度Convulxin诱导血小板聚集的信号转导过程中,我们发现Syk-P的表达量显著降低(P<0.01)。本项实验证明先证者2低浓度胶原诱导血小板聚集缺陷与FLNA基因的1582G>A杂合突变相关。