动脉粥样硬化(atherosclerosis,As)是As性心脑血管疾病的共同病理改变,其中巨噬细胞脂质蓄积和炎症反应在As发生发展中起着重要作用。减轻巨噬细胞脂质蓄积和炎症反应的调控措施对防治As性心脑血管疾病具有重要意义。脂蛋白脂酶(lipoprotein lipase,LPL)是水解甘油三酯的关键限速酶,与As性心脑血管疾病密切相关。越来越多的研究显示,特异性敲除apo E-/-小鼠或As模型兔巨噬细胞中LPL,可以明显改善该小鼠或兔主动脉壁上脂质沉积和As斑块面积,提示巨噬细胞源性LPL主要发挥致As作用。一方面,巨噬细胞LPL能通过促进脂质摄取而引起细胞内脂质过度蓄积。另一方面,巨噬细胞LPL还上调各种炎症因子表达。研究者们正努力寻找调控因子直接抑制体内巨噬细胞LPL表达,为防治As性心脑血管疾病提供新的治疗策略。Micro RNAs是一类长约18-22个核苷酸的内生性单链成熟非编码RNA,通过形成RNA诱导沉默复合体(RNA induced silencing complex,RISC)与靶标基因m RNA的3’非翻译区(3’-untranslated regions,3’UTR)发生完全或不完全配对,进而促进m RNA的切割降解和翻译受抑,在转录后水平调控靶标基因的表达,已经成为As重要的防治靶标。mi R-590位于人类基因组7号染色体长臂近端。目前研究发现,mi R-590参与保护血管、调节脂质、预防心梗等作用,与As性心脑血管疾病密切相关。在心血管疾病中mi R-590表达下调,提示其可能是一种保护性micro RNA,但具体机制尚未明了。利用生物信息学分析,我们发现mi R-590恰好具有靶向调控LPL的生物学基础。我们的预实验结果显示,过表达mi R-590可以沉默THP-1巨噬细胞LPL m RNA和蛋白质的表达。因此我们提出“mi R-590通过直接靶向结合LPL 3’UTR,沉默其表达,进而抑制巨噬细胞脂质蓄积和炎症反应,发挥抗As的工作假说”。第一部分mi R-590对巨噬细胞脂质蓄积和炎症因子分泌的影响目的:观察过表达或抑制mi R-590对巨噬细胞胞内脂质蓄积及培养基炎症因子水平的影响。方法:培养人THP-1和小鼠RAW264.7单核细胞并诱导分化成巨噬细胞,分为4组:mi R-590 mimic转染组,mimic-negnative对照组,mi R-590 inhibitor转染组和inhibitor-negnative对照组,实时定量PCR结果检测各组mi R-590的表达水平。采用油红O染色显示巨噬细胞脂质蓄积情况,HPLC法检测巨噬细胞内总胆固醇(total cholesterol,TC)、游离胆固醇(free cholesterol,FC)和胆固醇酯(cholesterol ester,CE)的含量。ELISA检测巨噬细胞白细胞介素-6(interleukin-6,IL-6)、白细胞介素1β(interleukin-1beta,IL-1β)、肿瘤坏死因子α(tumor necrosis factor-alpha,TNF-α)和单核趋化蛋白-1(monocyte chemoattractant protein-1,MCP-1)的表达。结果:①巨噬细胞转染mi R-590 mimic可显著增加mi R-590的表达,转染mi R-590 inhibitor可抑制mi R-590的表达。②油红O染色法和HPLC法检测显示mi R-590 mimic可显著降低巨噬细胞内脂滴体积、数量,减少胞内TC、FC和CE含量,mi R-590 inhibitor则显著增加巨噬细胞内脂滴体积、数量,升高胞内TC、FC和CE含量。③ELISA结果显示mi R-590mimic可显著降低巨噬细胞IL-6、IL-1β、TNF-α和MCP-1的水平,而mi R-590inhibitor促进巨噬细胞炎症因子的产生。结论:①mi R-590可抑制巨噬细胞脂质蓄积;②mi R-590可抑制巨噬细胞炎症因子IL-6、IL-1β、TNF-α和MCP-1的分泌。第二部分mi R-590通过靶向抑制LPL减少巨噬细胞脂质蓄积和炎症因子分泌目的:探讨mi R-590是否与LPL3’UTR靶向结合并抑制其表达;观察过表达或沉默LPL后,mi R-590对巨噬细胞脂质蓄积及炎症因子分泌的作用及机制。方法:利用多个micro RNA公共数据库及在线软件分析预测各物种mi R-590保守性、LPL3’UTR序列、mi R-590靶标基因、mi R-590与LPL靶标结合评分、结合位点、茎环结构及自由能。采用双荧光素酶报告基因法检测mi R-590是否与LPL3’UTR具有靶向结合作用。人THP-1和小鼠RAW 264.7巨噬细胞分为:mi R-590 mimic转染组,mimic-negnative对照组,mi R-590 inhibitor转染组和inhibitor-negnative对照组,采用实时定量PCR和Western blot法检测LPL m RNA和蛋白水平。利用试剂盒检测了mi R-590对巨噬细胞培养液中LPL活性的影响。在人THP-1巨噬细胞中采用si RNA干扰技术抑制内源性LPL或加入小牛LPL,油红O染色法观察mi R-590 mimic或mi R-590 inhibitor对巨噬细胞中脂质蓄积情况的影响,采用HPLC法检测mi R-590 mimic或mi R-590 inhibitor对细胞内TC、FC和CE含量的影响,并检测了mi R-590对巨噬细胞表面负责脂质摄入的清道夫受体SRA1和CD36表达的影响。采用ELISA检测mi R-590 mimic或mi R-590 inhibitor对细胞内IL-6、IL-1β、TNF-α和MCP-1分泌的影响。此外,我们还检测了mi R-590对人THP-1巨噬细胞中磷脂成份的影响。结果:①生物信息学分析结果显示mi R-590高度保守,在物种进化及靶标基因调控中起关键作用;多个靶标预测网站发现mi R-590恰好具有靶向调控LPL的生物学基础。②293T细胞转染LPL野生型3’UTR报告基因后,mi R-590mimic组双荧光素酶活性与其正常对照组相比明显降低,而mi R-590 inhibitor组双荧光素酶活性相对值明显增加。③实时定量PCR和Western blot结果显示转染mi R-590 mimic能下调人THP-1和小鼠RAW 264.7细胞LPLm RNA和蛋白质表达,而mi R-590inhibitor增加巨噬细胞LPLm RNA和蛋白质表达。④mi R-590 mimic能使人THP-1细胞和鼠RAW 264.7细胞LPL活性下降,mi R-590 inhibitor则显著增加巨噬细胞LPL活性。⑤在mi R-590 mimic转染基础上加入牛LPL可逆转mi R-590 mimic降低巨噬细胞内脂质水平的趋势;mi R-590inhibitor转染基础上进行LPLsi RNA干扰则逆转mi R-590 inhibitor增加巨噬细胞内脂质水平的趋势。⑥转染mi R-590 mimic的巨噬细胞中清道夫受体SRA1和CD36 m RNA和蛋白表达明显下降,在mi R-590 mimic组加入LPL可逆转此趋势;转染mi R-590 inhibitor的巨噬细胞中SRA1和CD36 m RNA和蛋白表达明显增加,在mi R-590 inhibitor组沉默LPL后可逆转此趋势。⑦在mi R-590 mimic转染基础上加入LPL可逆转mi R-590 mimic降低巨噬细胞内炎症因子分泌的趋势;mi R-590 inhibitor基础上进行LPLsi RNA干扰则逆转mi R-590 inhibitor增加巨噬细胞内炎症因子水平的趋势。⑧mi R-590 mimic组lyso-PC水平下降,卵磷脂相对增加;而mi R-590 inhibitor组lyso-PC水平上升,卵磷脂水平下降。mi R-590 mimic加入LPL或mi R-590 inhibitor沉默LPL两组lyso-PC的水平与对照组无统计学差异。结论:①mi R-590具有靶向作用人/鼠LPL的生物信息学基础,能够结合巨噬细胞LPL3’UTR;②mi R-590可抑制巨噬细胞中LPLm RNA和蛋白质的表达;③mi R-590通过靶向抑制LPL减少巨噬细胞脂质蓄积和炎症因子的产生。第三部分mi R-590对apo E-/-小鼠动脉粥样硬化病变和体内炎症因子水平的影响目的:观察mi R-590对apo E-/-小鼠As病变、主动脉壁内脂质蓄积、血脂水平、炎症因子及LPL表达的影响。方法:8周龄雄性apo E-/-小鼠采用高脂高胆固醇饮食喂养,并随机分为4组(每组15只):mi R-590 agomir group(AG)组、mi R-590 scrambled agomir group(AG-Con)组、mi R-590 antagomir group(AN)组、mi R-590scrambled antagomir group(AN-Con)组。其中,在AG组或AN组中,以80 mg/kg/d剂量溶入0.2ml生理盐水中,行尾静脉注射,每4周注射一次。8周后处死动物,体视显微镜下观察血管As形成情况;全自动生化分析仪检测甘油三酯(triglyceride,TG)、总胆固醇(total cholesterol,TC)、高密度脂蛋白胆固醇(HDL-C)、低密度脂蛋白胆固醇(LDL-C)的水平;苏丹Ⅳ染色和油红O染色观察主动脉和主动脉窦As病变处脂质蓄积情况;Masson氏染色法检测斑块胶原纤维面积;免疫荧光双标技术检测LPL在斑块中与巨噬细胞共定位情况与表达;实时定量PCR和Western blot法检测小鼠主动脉组织和腹腔巨噬细胞LPL m RNA和蛋白质的表达;HPLC法检测apo E-/-小鼠腹腔巨噬细胞中脂质水平;实时定量PCR及Western blot检测了apo E-/-小鼠腹腔巨噬细胞SRA1和CD36的表达;ELISA法检测血清炎症细胞因子的表达。结果:①主动脉体视显微镜观察和苏丹Ⅳ染色结果显示,mi R-590AG组小鼠主动脉内斑块较AG-Con组显著减少,而mi R-590AN组小鼠主动脉内斑块较AN-Con组显著增加。②油红O染色显示,与AG-Con组相比,AG组小鼠主动脉窦斑块脂质蓄积明显减少;与AN-Con组相比,AN组小鼠的主动脉窦处的病变脂质蓄积明显增加。③Masson三色染色结果显示,AG组小鼠主动脉窦病变胶原纤维含量较AG-Con对照组显著减少;与AN-Con对照组相比,AN组小鼠的主动脉窦处的病变胶原纤维含量显著增加。④免疫荧光双标技术检测显示主动脉根部AS病变区LPL表达阳性区域与巨噬细胞表达丰富区域一致。与AG-Con对照组相比,mi R-590AG组小鼠主动脉窦As病变中巨噬细胞LPL表达显著减少;与AN-Con对照组相比,mi R-590AN组小鼠主动脉窦As病变中巨噬细胞LPL表达显著增加。⑤实时定量PCR和Western blot结果显示,mi R-590AG组小鼠主动脉和腹腔巨噬细胞LPLm RNA和蛋白质表达较AG-Con组明显降低;mi R-590AN组小鼠主动脉和腹腔巨噬细胞LPLm RNA和蛋白质表达较AN-Con组明显升高。⑥全自动生化分析仪检测显示,mi R-590AG组小鼠TG水平较AG-Con组升高,TC、LDL-C水平明显降低;mi R-590 AN组小鼠TG水平较AN-Con组降低,TC、LDL-C水平明显升高。⑦HPLC结果显示,与AG-Con对照组相比,mi R-590AG组小鼠腹腔巨噬细胞脂质水平明显降低;与AN-Con对照组相比,mi R-590AN组小鼠腹腔巨噬细胞中脂质水平显著升高。⑧实时定量PCR及Western blot结果显示,mi R-590过表达后可明显降低apo E-/-小鼠腹腔巨噬细胞SRA1和CD36的表达,而抑制mi R-590后,SRA1和CD36的表达升高。⑨采用ELISA法检测结果显示,与AG-Con对照组相比,mi R-590AG组小鼠血浆IL-6、IL-1β、TNF-α和MCP-1水平明显降低;与AN-Con对照组相比,mi R-590AN组小鼠血浆炎症因子水平显著升高。结论:①mi R-590抑制apo E-/-小鼠As病变的发生发展;②mi R-590抑制apo E-/-小鼠As病损、As斑块内的脂质蓄积、血浆脂质水平和炎症因子表达;③mi R-590可能通过抑制巨噬细胞LPL延缓apo E-/-小鼠血管壁As的形成。第四部分川陈皮素对apo E-/-小鼠mi R-590/LPL水平及动脉粥样硬化病变的影响目的:观察川陈皮素对THP-1巨噬细胞mi R-590水平、LPL表达和apo E-/-鼠主动脉As病变、斑块脂质蓄积、血脂及血浆炎症因子水平的影响。方法:培养THP-1巨噬细胞,以不同浓度(0,10,20,40,80μM)川陈皮素处理24 h或40μM川陈皮素处理不同时间(0,6,12,24,48h),Western blot检测川陈皮素处理对LPL蛋白质表达的影响。用40μM的川陈皮素孵育THP-1巨噬细胞共孵育24h,实时定量PCR检测川陈皮素对THP-1巨噬细胞中mi R-590水平的影响。THP-1巨噬细胞转染mi R-590 mimic/inhibitor,Western blot检测川陈皮素对巨噬细胞LPL蛋白质表达的影响;HPLC法和油红O染色观察川陈皮素对巨噬细胞脂质含量的影响;ELISA检测川陈皮素对细胞培养液中炎症因子分泌的影响。苏丹Ⅳ染色显示川陈皮素对主动脉内膜面As病变面积的影响。油红O染色观察川陈皮素对apo E-/-小鼠主动脉窦脂质蓄积的影响。Masson染色观察川陈皮素对apo E-/-小鼠主动脉窦As斑块胶原纤维的影响。取小鼠新鲜血清,检测川陈皮素对各组apo E-/-鼠血清TG、TC、HDL-C和LDL-C的水平。ELISA法检测川陈皮素对apo E-/-小鼠血浆炎症因子水平的影响。采用Western blot检测川陈皮素对apo E-/-小鼠主动脉LPL蛋白表达的影响。结果:①川陈皮素下调THP-1巨噬细胞LPL蛋白质表达,并呈剂量和时间依赖性;②PCR结果显示,川陈皮素明显上调THP-1巨噬细胞中mi R-590水平;③巨噬细胞转染mi R-590 mimic后明显增强川陈皮素抑制LPL表达的作用,转染mi R-590 inhibitor后则减轻川陈皮素抑制LPL表达的作用;④HPLC检测和油红O染色显示川陈皮素减少THP-1巨噬细胞脂质含量,Nob(川陈皮素)+mi R-590 mimic组巨噬细胞内脂质含量则更加减少,而Nob+mi R-590 inhibitor组巨噬细胞内脂质水平有所增加,基本上达到对照组水平;⑤ELISA检测结果显示,相较于对照组,川陈皮素减少THP-1巨噬细胞内IL-6、IL-1β、TNF-α和MCP-1炎症因子的分泌,Nob+mi R-590mimic组巨噬细胞分泌的炎症因子更加减少,而Nob+mi R-590 inhibitor组巨噬细胞内炎症因子水平有所增加,与对照组水平无差异。⑥苏丹Ⅳ染色液染色显示与对照组相比,Nob组小鼠主动脉斑块面积明显减少;而Nob+AG组小鼠主动脉的斑块面积更为减少,Nob+AN组动物主动脉处的斑块面积有所增加;⑦油红O染色显示,Nob组实验动物主动脉窦处脂质蓄积较对照组明显减轻;而Nob+AG组动物主动脉窦处的脂质蓄积减少更为明显;Nob+AN组动物主动脉窦处的脂质蓄积有所增加;⑧Masson染色显示与对照组相比,Nob组实验动物主动脉窦处胶原纤维含量减少;而Nob+AG组动物主动脉窦处的病变区胶原纤维含量减少更为明显;而Nob+AN组动物主动脉窦处的病变区胶原纤维含量较Nob组实验动物有增加;⑨与对照组比较,Nob组动物的血浆HDL-C水平有所升高,TG、TC及LDL-C水平均明显降低;Nob+AG组动物的血浆HDL-C水平亦有所升高,TC及LDL-C水平降低较Nob组更为明显,TG水平无变化;而Nob+AN组动物的血浆HDL-C水平有所升高,与Nob组无差异,TG水平下降,TC及LDL-C水平较Nob组有所上升。⑩ELISA法检测结果显示,与对照组相比,Nob组实验动物血浆炎症因子IL-6、IL-1β、TNF-α和MCP-1水平减少;Nob+AG组实验动物血浆炎症因子分泌降低更为明显;而Nob+AN组实验动物血浆炎症因子分泌有所增加,与对照组水平无统计学差异。○11 Western blot检测显示,与对照组相比,Nob组小鼠主动脉LPL蛋白表达明显降低;Nob+AG组主动脉LPL蛋白表达降低更为明显;而Nob+AN组主动脉LPL蛋白表达有所增加。结论:①川陈皮素抗apo E-/-小鼠As的作用与其抗炎和降脂功能有关;②川陈皮素可上调mi R-590水平,降低巨噬细胞LPL的表达,减少As斑块形成。