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目的:当前乳腺癌已成为对妇女健康危害最严重的肿瘤之一,每年大约有数十万人死于乳腺癌。而其中的三阴乳腺癌占了全部乳腺癌的15%左右,具有高侵袭性、易转移复发、预后差等特点。目前对于三阴乳腺癌来说,临床上存在的不足之处是单靶点CAR-T治疗三阴乳腺癌效果欠佳。主要原因是肿瘤细胞会发生抗原逃逸,对单抗原靶向的CAR-T细胞产生耐药,易复发,即本论文要解决的关键科学问题,而采用双靶点CAR-T设计有望较好解决这些不足,提高CAR-T治疗的效果。本研究的目的是通过构建双靶点增强型CAR-T,验证其对三阴乳腺癌细胞系的杀伤效果。由于NKG2D和间皮素（Mesothelin）这两个靶点的覆盖面广且表达呈负相关,因此本研究为了解决单靶点CAR-T治疗三阴乳腺癌疗效不佳的问题,设计串联的联合应用靶向Mesothelin和NKG2D的双靶点CAR-T,改善CAR-T的治疗效果。第一步是对基于靶向Mesothelin的两种不同的抗体（scFv、VHH）序列构建的CAR-T杀伤三阴乳腺癌细胞的效果进行对比,选择其中效果最佳的一个序列,为后续双靶点CAR序列的选择提供参考。第二步是联合应用靶向Mesothelin和NKG2D设计双靶点CAR序列,比较构建的双靶点CAR-T与各单靶点CAR-T杀伤三阴乳腺癌细胞系的效果;此外,加入双特异性T细胞接合剂（bispecific T cell engagers,BiTE）设计,验证构建的CART·BiTE杀伤三阴乳腺癌细胞系的效果。方法:一、构建两种靶向Mesothelin的CAR-T细胞,比较杀伤三阴乳腺癌细胞系的效果基于scFv和VHH的序列构建scFv CAR和VHH CAR载体,包装慢病毒并感染人原代T细胞,制备scFv CAR-T和VHH CAR-T细胞。利用实时无标记细胞分析技术检测两种CAR-T细胞对过表达Mesothelin的MDA-MB-231细胞的体外杀伤能力,流式细胞术检测CAR-T杀伤靶细胞后细胞因子分泌和CD107a、CD69、PD-1的表达情况。二、构建联合应用靶向Mesothelin和NKG2D的CAR-T细胞,验证其杀伤三阴乳腺癌细胞系效果在上一步比较两种靶向Mesothelin的CAR-T细胞杀伤效果中,选择杀伤效果最优的VHH序列,再设计串联另一个靶向NKG2D的序列,基于以上两个序列构建双靶点CAR载体,包装慢病毒并感染人原代T细胞,制备双靶点CAR-T细胞。利用实时无标记细胞分析技术检测Mesothelin CAR-T、NKG2D CAR-T和双靶点CAR-T细胞分别对过表达Mesothelin的MDA-MB-231细胞的杀伤能力,流式细胞术检测CAR-T细胞杀伤靶细胞后细胞因子分泌和CD107a、CD69、PD-1的表达情况。三、加入“BiTE”设计,构建Mesothelin CART·BiTE细胞,验证其杀伤三阴乳腺癌细胞系的效果在前面研究的基础上,加入“BiTE”设计,构建Mesothelin VHH BiTE（CD3-NKG2D）CAR载体,包装慢病毒并感染人原代T细胞,制备Mesothelin CART·BiTE细胞。利用Western Blot检测细胞分泌的“BiTE”上清,实时无标记细胞分析技术检测Mesothelin CART·BiTE细胞对过表达MICA的MDA-MB-231细胞的杀伤能力,以及检测“BiTE”分泌上清促进T细胞对过表达Mesothelin的MDA-MB-231细胞的杀伤能力,流式细胞术检测CAR-T细胞杀伤靶细胞后细胞因子分泌和CD107a、CD69、PD-1的表达情况。结果:一、成功构建过表达Mesothelin的MDA-MB-231细胞和过表达MHC-Ⅰ类分子相关基因A（MICA）的MDA-MB-231细胞,为后续的杀伤实验提供了基础。二、成功构建靶向Mesothelin的scFv CAR-T和VHH CAR-T细胞,通过其体外杀伤三阴乳腺癌细胞系的效果比较,选择杀伤效果较好的Mesothelin VHH CAR-T细胞作为后续双靶点CAR设计的基础,这也是目前报道的第一个基于VHH序列构建的Mesothelin CAR-T。三、成功构建联合应用靶向Mesothelin和NKG2D的双靶点CAR-T细胞,分别为1-NKG2D-MSLN（Mesothelin）CAR-T细胞和2-MSLN-NKG2D CAR-T细胞,通过其体外杀伤三阴乳腺癌细胞系的效果比较,选择杀伤效果较好的2-MSLN-NKG2D CAR-T细胞,验证其比各单靶点CAR-T细胞展现出更强的杀伤效果,且综合分析其在表达CD107a、CD69、PD-1和分泌细胞因子上展现出更佳优势。四、成功构建具有靶向杀伤性的Mesothelin CART·BiTE细胞,验证其比Mesothelin CAR-T细胞展现出更强的杀伤效果,且利用Western Blot验证细胞分泌的“BiTE”上清具有促进T细胞杀伤效果。结论:针对目前临床上单靶点CAR-T治疗三阴乳腺癌效果欠佳的问题,本研究通过构建联合靶向Mesothelin和NKG2D的双CAR-T细胞和Mesothelin CART·BiTE细胞在体外验证了其对杀伤三阴乳腺癌细胞系的效果优于各自的单靶点CAR-T,且综合分析上看双CAR-T细胞的活化程度更高,表达的细胞因子水平更高,这为后续提高CAR-T治疗三阴乳腺癌效果的研究提供良好基础。主要内容如下:一、本实验成功构建具有靶向杀伤性的Mesothelin VHH CAR-T细胞,且构建的Mesothelin VHH CAR-T对三阴乳腺癌细胞的杀伤能力优于临床上常用的Mesothelin scFv CAR-T,为后续设计双靶点CAR序列的选择提供参考,这也是目前报道的第一个基于VHH序列构建的Mesothelin CAR-T。二、本实验成功构建具有靶向杀伤性的双靶点2-MSLN-NKG2D CAR-T细胞和Mesothelin CART·BiTE细胞,与各单靶点CAR-T相比,验证构建的2-MSLN-NKG2D CAR-T和Mesothelin CART·BiTE细胞对三阴乳腺癌细胞均展现出更强的杀伤活性及靶向性。