L-色氨酸是人和动物生命活动中必需的氨基酸之一,目前L-色氨酸已经广泛应用于医药、食品及饲料等方面,其中饲料方面的需求量最大。本文以代谢工程理论为指导,以L-色氨酸生产菌E.coli_TRTH为出发菌株,针对不同代谢问题分别构建了不同基因缺失或过表达的L-色氨酸工程菌株。为了减少三羧酸循环对磷酸烯醇式丙酮酸(PEP)的消耗,使PEP更多的合成L-色氨酸,本文构建了基因ptsG(编码葡萄糖特异性转运蛋白EIICBGlc,TCA循环消耗PEP的关键蛋白)缺失的L-色氨酸生产菌E.coli TRTHΔptsG。在此基础上过表达了编码大肠杆菌葡萄糖激酶的glk和编码运动发酵单胞菌葡萄糖转运蛋白的基因glf,得到TRTH(pSTV28-KTF)ΔptsG。5 L发酵罐分批补料发酵实验结果显示,重组菌 TRTH(pSTV28-KTF)ΔptsG 和 TRTH(pSTV28)ΔptsG 的生物量(g DCW/L)和L-色氨酸产量分别达到16.24、4.58g和10.25g/L、3.1g/L,较出发菌TRTH分别下降49.12%、85.84%和61.32 g/L和88.30%。以上结果表明:ptsG的缺失对菌体的生长代谢影响较大。虽然glk和glf的过表达一定程度上改善了菌体的糖转运,但仍然不能弥补ptsG缺失对菌体造成的影响。为了进一步增加碳源流向L-色氨酸合成途径,构建了基因ppc(编码磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶)缺失的L-色氨酸生产菌E.coliTRTHΔppc。摇瓶补料发酵结果显示:TRTHΔppc的生物量、L-色氨酸产量和乙酸积累量分别为1.38 g DCW/L,1.5 g/L,和3.4 g/L,分别是出发菌的18.60%、28.30%和32.69%。数据显示,ppc的缺失对TRTH的生长和产酸能力有部分影响。向发酵培养基中补加琥珀酸后,菌体的生长和产酸能力并未较之前有好转,表明ppc的缺失并未影响TRTH的产琥珀酸能力。为了强化乙醛酸循环,减少TCA循环的CO2损失,形成更经济的代谢方式,本文构建了基因iclR(编码乙醛酸操纵子阻遏蛋白)缺失的L-色氨酸生产菌Ecoli TRTHAiclR。摇瓶分批补料发酵结果显示:TRTHAiclR的L-色氨酸产量、糖酸转化率分别达到6.52 ±0.46 g/L和13.17%,比原菌分别提高了 21.32%和22.41%;乙酸累积量为6.82 g/L,比原菌降低了 37.63%。30 L发酵罐分批补料发酵显示:TRTHAiclR的L-色氨酸产量及糖酸转化率分别达到13.01 ± 1.05 g/L和6.51%,比原菌下降了 60.42%和68.31%;乙酸累积量为18.21 g/L,比原菌增加了 33.42%;以上结果表明,发酵罐条件下,乙醛酸循环的增强导致重组菌株供能不足和乙酸的过多积累,最终使得生物量不足以及L-色氨酸产量下降。以上改造菌株测试后,均有不同程度的能量供应不足,故为了增加胞内ATP水平,分别敲除了与ATP能量代谢相关的三个基因ysaA、ydaS和y iX,相继构建了TRTHAysaA、TRTHAydaS 和 TRTHAybiX 和 TRTHAysaAAydaS。摇瓶分批补料发酵实验结果显示:三株单敲除菌的生物量、L-色氨酸产量和糖酸转化率较出发菌均有不同程度的提高。而双敲除菌的以上指标略有下降。30 L发酵罐分批补料发酵实验结果显示:TRTHAysaA、TRTHAydaS、TRTHAybiX 和 TRTHAysaAAydaS 生物量和L-色氨酸产量叫出发菌均有下降。胞内ATP(mmol/L)浓度最高值均在细胞生长前期,在4 h达到3.20、7.04、6.04和7.13,除TRTHAysaA外,其他三株重组菌均与出发菌基本持平,但此后则胞内ATP浓度迅速下降,明显低于出发菌同时期水平。以上结果表明,强化能量供应还应更精细和系统的操作,否则效果不佳。最后,采用单因素实验对30 L发酵罐培养L-色氨酸生产菌E.coli TRTH的初始发酵培养基进行优化。得到最优培养基为:葡萄糖7.5 g/L,酵母粉1 g/L,棉籽精粉 20 g/L,柠檬酸 2 g/L,(NH4)2S041.6g/L,K2HP047.5 g/L,MgS04.7H20 1.6 g/L,微量元素1 mL/L。此配方对菌体积累L-色氨酸具有明显的促进作用,使L-色氨酸产量有了较大提升,达到了 40.52 g/L,比原配方(32.5 g/L)提高了 24.62%。