脊髓损伤(spinal cord injury, SCI)以其高致残率和死亡率而倍受关注。SCI的最终神经学损害由两种机制引起,即原发性损伤和继发性损伤。前者包括机械压迫、出血、电解质从受损细胞中外溢等;后者包括水肿、炎症反应、局部缺血、生长因子、细胞因子、再灌注、Ca2+溢出以及过氧化基团异常变化等对脊髓产生的损害作用。近年来对SCI的研究主要集中在损伤后期组织再生方面,如神经干细胞移植或嗅鞘细胞移植等,但收效甚微。主要原因就是忽略了继发性损伤带来的严重影响,损伤早期残存的神经元没有得到及时的保护,从而导致后期再生的先决条件欠缺。对于SCI来说,原发性损伤是一个不可逆转的过程,而继发性损伤则是一个可逆且可控的过程。因此,在减低原发性损伤因素的同时,应用多种手段,如减轻炎症免疫反应、阻断神经毒性损伤、减少凋亡发生等,尽可能把继发性损伤的程度降到最低,已成为SCI早期治疗的研究热点。在继发性损伤早期,存在一个重要的炎症反应过程,它能触发其后发生的一系列针对受损部位细胞和分子水平的反应;此外,炎症反应可以导致受损局部胶质瘢痕的形成,从而进一步阻碍再生。抑制炎症反应能够促进中枢神经系统(central nervous system, CNS)的再生与功能恢复。值得注意的是,炎症过程引起了补体系统的激活,激活的补体片段又能通过多种途径导致炎症反应,对自身组织成分造成损害,加重SCI后的继发性损伤。那么是否可以通过阻断补体系统的激活来抑制炎症反应,从而减轻SCI后的继发性损伤呢?通过何种方式才能阻断补体系统的激活呢?我们选择敲除补体C3基因。因为已知补体系统的三条激活途径——包括经典途径、凝集素途径和旁路途径,虽然启动途径不同,但最后都汇集于一点,即C3转化酶对C3的分解,并在分解之后的活化过程中产生许多具有炎症介质作用的活性片断,如C3a、C4a和C5a等,最后进入共同的末端通路,形成攻膜复合体(membrane attack complx,MAC),并导致炎症反应。可见C3在补体系统已知的三条激活途径中处于枢纽地位,是补体系统激活的必要条件。本研究的目的就是通过敲除补体C3基因来抑制炎症反应,从而减轻继发性损伤,促进SCI后的再生和功能恢复。实验动物分为WT组(野生型)和KO组(敲基因型),所有实验均在两组之间同时比较进行。参照改良Allen打击法,建立C3敲基因小鼠脊髓撞击伤模型,撞击位置为T12,撞击强度为5g×6cm,在此基础上进行Basso, Beattie and Bresnahan (BBB)行为学评分,并在SCI后不同时间(1h、12h、24h)分别用TNF-α抗体、星形胶质细胞(astrocytes,AST)的标记物GFAP抗体以及再生抑制相关蛋白NgR抗体和RhoA抗体进行免疫组织化学染色,用western blot检测SCI后1h、2h、6h、12h、24h TNF-α蛋白的表达,RT-PCR检测SCI后24h RhoA mRNA的表达,用神经元的标记物NF-200抗体检测SCI后14d和21d神经纤维再生情况,观察敲除补体C3基因对SCI后炎症因子TNF-α的表达、AST的活化、神经纤维的再生以及再生抑制相关蛋白NgR、RhoA表达的影响,以此验证通过敲除补体C3基因来抑制炎症反应、减轻继发性损伤从而促进再生的可行性。为了排除实验动物个体差异和在体诸多干扰因素的影响,又设计了体外实验。首先纯化培养AST和神经元,达到一定生长状态后,用无菌注射器针头呈“#”字形划伤,建立离体培养AST和神经元机械性损伤模型,ELISA检测细胞损伤后不同时间(1h、2h、6h、12h、24h、48h)培养上清中TNF-α的分泌情况,以验证C3基因敲除对炎症反应的抑制。随后将小鼠背根神经节(dorsal root ganglion, DRG)与机械划伤后的AST共培养,分别于1d、2d、3d、4d观察DRG神经突起生长状况。主要结果:1、建立了小鼠脊髓撞击伤模型,撞击位置为T12,撞击强度为5g×6cm,SCI后小鼠呈现典型的截瘫症状;2、SCI后,WT组和KO组24h内病理学观察结果相似:损伤区结构破坏,灰质多灶性出血,损伤中心出现空腔,面积随时间延长逐渐增大;3、SCI后,KO组小鼠BBB评分明显高于WT组,21d时KO组得分为17±0.8,已接近正常小鼠,而WT组得分仅为11±0.2;4、Western blot和TNF-α免疫组织化学结果均表明,与WT组相比,KO组SCI后各时间点TNF-α免疫反应阳性细胞数目与免疫反应强度均比较稳定,高于KO组假手术对照,低于WT组表达的最高峰(6h);5、KO组小鼠SCI后,活化AST数目和活化持续时间明显减少;6、SCI后KO组小鼠再生神经纤维密度和长度均明显优于WT组;7、SCI后,KO组再生抑制相关蛋白NgR、RhoA等的表达均有升高,但与WT组无明显区别。而western blot结果却表明SCI后,虽然WT组RhoA mRNA的表达升高,但KO组却并未升高;8、ELISA检测AST和神经元机械性损伤模型上清液中TNF-α含量,发现机械性损伤后,无论是AST还是神经元,WT组TNF-α的表达在1h至48h均显著增加(p<0.05),6h达到最高峰。而KO组TNF-α的表达量未见显著升高;9、建立了DRG与AST机械性损伤模型共培养体系,发现DRG + AST(WT,未损伤)和DRG + AST(KO,未损伤)两组中的DRG神经突起生长状况最好,突起长,密度大。DRG + AST(WT,损伤)和DRG + AST(KO,损伤)两组中的DRG神经突起生长都受到了抑制,前者受到的抑制作用最明显,神经突起长度最短,密度最小;后者受到的抑制作用较小,神经突起长度和密度介于DRG + AST(WT/KO,未损伤)和DRG + AST(WT,损伤)之间。主要结论:1. C3基因敲除能够有效抑制小鼠SCI后炎症因子TNF-α的表达,减轻炎症反应;2. C3基因敲除能够减少活化AST数目和持续时间,有利于减少炎症因子的释放、减轻继发性损伤、改善再生环境,促进神经再生和功能恢复;3. C3基因敲除后,小鼠神经纤维再生情况得到显著改善,运动能力得到较好恢复;4. C3基因敲除能够抑制体外培养的AST和神经元分泌TNF-α,有效改善神经突起生长的微环境,促进再生。总之,本研究通过建立C3敲基因小鼠脊髓撞击伤模型和DRG与AST机械性损伤模型共培养体系,运用免疫组织化学法、免疫荧光双标、western blot、RT-PCR、细胞培养以及ELISA等方法,证明敲除补体C3基因能够在一定程度上抑制炎症反应,减轻继发性损伤,促进神经再生和功能恢复。说明通过阻断补体系统激活来促进SCI后的神经再生与功能恢复不失为一条可行的新途径,为研究脊髓继发性损伤、促进CNS再生提供了新思路。