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研究背景：肝细胞肝癌是最常见的消化系统恶性肿瘤之一。中国是乙肝高发国家,每年肝癌新增病例占全球的一半以上。肝癌恶性程度高,起病隐匿,进展快。肝癌切除术和肝移植是肝癌最有效的根治性手段,但术后复发率较高。仅部分早期肝癌的患者适合接受手术治疗,不可切除肝癌或晚期肝癌预后差。因此,肝癌诊断和预后评判新型标记物以及药物治疗靶点的研发至关重要。研究目的：本研究拟通过蛋白质组学技术筛选肝细胞肝癌组织与配对癌旁组织间差异表达的蛋白,进而在肝癌及癌旁组织中检测其表达水平,并开展体外、体内实验阐明具体作用机制,为新型肿瘤标记物和药物作用位点的研发提供理论基础。研究方法1.应用双向荧光差异凝胶电泳技术筛选3对肝癌组织(无血管侵犯、单发、肿瘤直径<5cm)及其配对癌旁组织间差异表达蛋白位点,并使用质谱鉴定。应用实时荧光定量PCR(qPCR, n=59)、Westen blot免疫印迹(n=16)、免疫组化(n=265)等方法在临床肝癌患者的肿瘤和配对癌旁组织中验证差异蛋白过氧化物酶6(Peroxiredoxin 6, PRDX6)的表达情况,并分析其与各临床指标及预后的相关性。结合正常肝脏组织(n=42)和肝硬化组织(n=48)分析其在肝癌发生过程中的表达水平变化。同时收集15例正常人及40例肝癌患者血清,检测PRDX6的血清学差异。2.应用肝癌HepG2和BEL-7402细胞株进行体外实验,使用慢病毒以及siRNA干扰调控PRDX6在肝癌细胞中的表达水平,通过集落形成、裸鼠成瘤实验、CCK8增殖实验、细胞周期实验、凋亡实验检测PRDX6对肿瘤细胞各项功能的影响。使用H2O2、肿瘤坏死因子-α/放线菌酮(TNF-a/CHX)等试剂诱导肿瘤细胞凋亡,检测PRDX6在不同条件下对凋亡的影响,并使用钙离子非依赖性磷脂酶A2(iPLA2)抑制剂-溴烯醇内酯(BEL溶液)来鉴定PRDX6特定活性的作用。结果1.凝胶电泳及质谱检测发现8个蛋白在肝癌及配对癌旁组织中表达有显著性差异,且差异倍数大于3,其中包括PRDX6蛋白,在癌旁组织中显著高表达(p<0.05)。肝癌组织Western blot、q-PCR及免疫组化检测证实癌旁组织中PRDX6表达显著升高(p<0.05)。免疫组化结果同时还显示,PRDX6在肝硬化组织中表达最低,正常肝组织中表达水平显著高于肝硬化组织,但显著低于癌旁组织(p<0.05)。肝癌组织中的PRDX6水平与术前血清AFP、组织分化程度显著相关(p<0.05),癌旁组织中PRDX6水平与肝硬化、肿瘤个数和大血管侵犯显著相关(p<0.05)。145例肝癌随访研究发现,肝癌组织PRDX6表达水平与预后不佳显著相关,且是肝癌预后的独立评判因子(p<0.05)。血清学检测发现PRDX6在肝癌患者血清中表达水平显著高于正常人(p<0.05)。2. PRDX6高表达能抑制集落形成及裸鼠移植瘤生长(p<0.05)。PRDX6低表达能降低BEL-7402的增殖活性。HepG2中PRDX6过表达能增加S期、减少G2期细胞数量,PRDX6沉默在HepG2和BEL-7402细胞中得到对应的相反结果.PRDX6过表达仅能在BEL-7402中增加细胞凋亡,而沉默后对凋亡无影响。H2O2诱导肝癌细胞凋亡的条件下,PRDX6过表达显著减少HepG2和BEL-7402细胞的凋亡,沉默后能增加HepG2和BEL-7402细胞凋亡；TNF-α/CHX诱导凋亡的条件下,PRDX6过表达能增加HepG2和BEL-7402细胞的凋亡,沉默后能减少HepG2和BEL-7402细胞凋亡。TNF-a/CHX诱导凋亡的条件下,加入iPLA2抑制剂能减少细胞凋亡,且作用与PRDX6表达水平相关。Western blot检测发现,TNF-a/CHX诱导凋亡条件下,PRDX6沉默能改变BAX、Caspase3和Caspase8的表达水平。结论1. PRDX6在肝癌血清及癌旁组织表达量升高,在肝硬化组织中表达量低,有望成为肝癌诊断、手术预后评判的重要分子标记物。2. PRDX6在H202或TNF-α环境下对肝癌细胞凋亡有不同的作用,但在肝癌发生发展过程中主要表现为抑制作用。