论文部分内容阅读
在泌乳期，乳腺对支链氨基酸(包括亮氨酸、异亮氨酸和缬氨酸)、精氨酸的分解代谢数量骤增。支链氨基酸(BCAA)用以合成谷氨酸、谷氨酰胺、丙氨酸、天冬氨酸和天冬酰胺，而精氨酸用以合成脯氨酸、谷氨酰胺，最终用作蛋白质合成。鉴于此，本文利用亮氨酸为模式BCAA，研究了泌乳期乳腺对BCAA代谢骤增的生理生化机制；除此之外，亦研究了亮氨酸、精氨酸对乳腺上皮细胞蛋白质周转的调节作用。在探究生理生化调节机理的试验中，约2×106个乳腺上皮细胞接种于1 mL含0.5 mML-亮氨酸和L-[1-14C]或L-[U-14C]亮氨酸的Krebs缓冲液培养基中，并在37℃条件下培养2 h，探讨：1)BCAA在牛、小鼠乳腺上皮细胞的代谢途径的异同；2)0-50μU/mL胰岛素、0-150 nM羟化可的松、0-20 ng/mL生长激素、0-200 ng/mL催乳素、0-300 pg/mL胰高血糖素等各自对BCAA代谢的调节作用；3)0-5 mM D-葡萄糖、0-2 mM L-谷氨酰胺、0-4 mM DL-β-羟基丁酸、0-2 mM油酸等能量物质各自对BCAA代谢的调节作用。在探究氨基酸对乳腺上皮细胞蛋白质周转的试验中，约2×106个乳腺上皮细胞接种于1 mL含0.5 mM L-亮氨酸、1 mM苯丙氨酸和L-[环2，4-3H]苯丙氨酸Krebs缓冲液培养基中，并在37℃条件下培养2 h；同时，在此培养基中加入0-2 mM亮氨酸、或精氨酸、脯氨酸，以检测它们各自对乳腺上皮细胞蛋白周转的调节作用。研究结果显示： (1)增加培养基亮氨酸的浓度(从0.25 mM至2 mM)，牛、小鼠乳腺上皮细胞对亮氨酸的摄取速率呈浓度依赖性地增加；并且，在同浓度的情况下，它们对亮氨酸的摄取速率、脱氨速率均相同。所不同的是，小鼠乳腺上皮细胞更多地将亮氨酸的碳架氧化分解为CO2，而牛乳腺上皮细胞更多地将其转化为α-KIC。这说明，不同物种乳腺对BCAA的利用和分解具有共性，亦有不同之处。对牛乳腺上皮细胞的进一步研究显示，BCAA的氨基被转至α-酮戊二酸而用于合成谷氨酸，随后进一步用于合成谷氨酰胺、天冬氨酸、天冬酰胺和丙氨酸。 (2)胰岛素和催乳素不影响亮氨酸在乳腺上皮细胞的转氨、脱羧速率，但生长激素能以剂量依赖方式地抑制亮氨酸(或BCAA)的转氨速率、脱羧、α-KIC净生成、谷氨酸和谷氨酰胺净生成的速率；相反，羟化可的松(一种肾上腺糖皮质激素)和胰高血糖素则起刺激作用。Western blot进一步分析显示，生长激素、强化可的松、胰高血糖素对BCAT和BCKAD E1α蛋白表达的调节作用与代谢结果相一致。由于泌乳期母畜血液中生长激素降低，而羟化可的松、胰高血糖素浓度增加，因此，可推测，这些生理激素的血液水平变化共同地调节了亮氨酸(或BCAA)的分解代谢和谷氨酸、谷氨酰胺的合成，从而调节了乳腺合成乳汁的能力。 (3)与缺乏葡萄糖相比，2 mM亮氨酸可使脱羧氧化速率降低60％(P<0.01)，但使α-KIC增加34％(P<0.01)。当培养基存在2 mM葡萄糖时，增加其至3或5 mM不改变亮氨酸的分解代谢速率。类似地，亮氨酸的分解代谢不受β-羟基丁酸的影响。与0或0.25 mM谷氨酰胺处理组相比，0.5和2 mM处理组降低了(P<0.05)亮氨酸的转运速率、脱氨速率、脱羧氧化速率。与此相反，增加培养基中的油酸水平可增加(P<0.05)亮氨酸的脱氨、脱羧氧化速率。一致地，Western blot分析显示，1 mM油酸显著增加了胞质BCAT的蛋白水平(P<0.05)，但降低P-E1α的蛋白水平(P<0.01)。综上，可推测，在泌乳早期，乳腺分解代谢BCAA不受血液低血糖和低酮体水平的影响，但增加母畜血液中油酸的水平可增加乳汁谷氨酰胺、谷氨酸、天冬氨酸、天冬氨酸和丙氨酸的含量。 (4)与0.1 mM处理组相比，提高培养基中亮氨酸的水平可使乳腺上皮细胞数量增加(P<0.05)，表明亮氨酸具有调节细胞生长、增殖、分化的作用。进一步研究显示，亮氨酸促进了细胞的蛋白合成速率(P<0.01)，但降低了蛋白降解速率(P<0.05)。一致地，Western blot分析显示，亮氨酸增加了细胞磷酸化mTOR(P-mTOR)(P<0.05)、磷酸化4E-BP1(P-4E-BP1)(P<0.05)和磷酸化S6K1(P-S6K1)(P<0.05)的蛋白水平，但降低泛素化蛋白(P<0.01)和蛋白酶体(P<0.01)的蛋白水平。这表明，亮氨酸可能是通过激活mTOR信号途径和抑制泛素化-蛋白酶体信号途径，增加细胞的蛋白周转，进而促进细胞的生长增殖。 (5)精氨酸有类似于亮氨酸的促乳腺上皮细胞生长、增殖的生物学作用，但其一个代谢产物--脯氨酸则对细胞的增殖、细胞蛋白周转及其涉及的信号途径无作用。这表明，精氨酸通过mTOR和泛素化.蛋白酶体信号通路促进乳腺上皮细胞增殖不依赖于脯氨酸。 综上，本研究结果表明，泌乳母畜的肾上腺糖皮质激素、胰高血糖素、生长激素、油酸的血液水平发生变化是乳腺分解BCAA的主要生理生化原因，这为我们调控乳汁中谷氨酸、谷氨酰胺、天冬酰胺、天冬氨酸和丙氨酸等传统定义的“非必需氨基酸”的含量提供了必要的参考。除本身是乳腺上皮细胞合成蛋白质“砖块”之外，亮氨酸(或BCAA)、精氨酸还可作为信号物质，调节乳腺上皮细胞的蛋白周转，进而促进细胞的生长、增殖、分化。