等离子射频消融汽化产物对兔正常成纤维样滑膜细胞(FLS)毒性作用的实验研究

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目的:研究等离子射频消融汽化产物对兔正常成纤维样滑膜细胞增殖、凋亡的影响及刺激炎症因子表达情况,明确汽化产物有无细胞毒性,明确汽化产物在关节腔内残留是否为关节镜术后不明原因滑膜炎的病因之一;为等离子射频消融系统的合理使用提供理论依据,并指导关节镜手术中对汽化产物的正确处理。方法:(1)取新西兰大白兔,耳缘静脉处推注空气,栓塞处死,无菌条件下提取膝关节滑膜组织,并采集兔关节软骨、半月板、滑膜组织20g放置于50m L等渗液中,室温(25℃)下模拟手术操作,用等离子射频消融至完全汽化,收集等离子射频消融汽化组织后的产物,加盖、密封条密封气溶液,室温避光保存。(2)兔滑膜细胞培养,培养成功后Vimentin免疫荧光鉴定,取第三代细胞以气溶液干扰,观察并拍照记录FLS培养过程中生长情况及予以气溶液干扰后形态变化。(3)实验分组:设置对照组和3个实验组(高浓度、中浓度、低浓度气溶液组)。(4)利用CCK-8法检测细胞增殖率,不同气溶液处理完毕后,正常培养条件下CCK-8试剂反应4h,用酶标仪测得吸光值,计算得各组细胞增殖率,并绘细胞生长曲线。(5)流式细胞仪检测细胞周期,计算分析G1期、S期、G2期各期细胞所占比例。(6)Annexin V-FITC/PI双染FLS,流式细胞仪检测FLS凋亡情况。(7)利用ELISA法检测气溶液处理后FLS上清液中IL-6及IL-8水平变化。结果:(1)细胞形态学观察提示予以气溶液干扰36h后,可见细胞形态呈凋亡改变。(2)CCK-8检测提示实验组FLS增殖率在24h、36h、48h、72h时间点较对照组均降低;对比同一检测时间点增殖率,整体趋势为随气溶液浓度增加,增殖率下降;同一浓度下气溶液处理时间越长,FLS增殖率越低。其中,在24h、36h、72h检测点各组间对比分析,增殖率差异有统计学意义(P<0.05);48h时,低浓度组与中浓度组比较,增殖率无明显差异(P>0.05)。(3)流式细胞周期检测显示实验组与对照组相比G1期细胞比例增加,差异有统计学意义(P<0.05),提示射频消融汽化产物可将FLS增殖阻滞于G1期。(4)流式细胞凋亡检测显示实验组较对照组细胞凋亡增加,气溶液浓度越大,细胞凋亡越明显(P<0.05)。(5)实验组FLS上清液中IL-6及IL-8表达水平较对照组明显升高(P<0.05)。结论:等离子射频消融汽化产物对正常FLS有细胞毒性作用,抑制正常FLS增殖,促进细胞凋亡,将细胞增殖阻滞于G1期,并上调了IL-6及IL-8炎症因子的表达。
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