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百草枯(paraquat,PQ)属联吡啶类除草剂,口服中毒是中毒的主要途径,PQ中毒病死率极高。目前PQ中毒机制尚不完全清楚,多认为PQ吸收后,产生大量的氧自由基引起组织器官细胞膜脂质过氧化,造成多器官功能障碍,其中以肺损伤最常见且最严重,常导致肺水肿及肺纤维化。并且目前尚无特效解毒治疗。我国是农药生产和使用的大国,随着国家卫生部“十年百项计划”急性有机磷农药中毒的合理救治取得了明显成绩;而世界范围内普遍使用的有机杂环类速效触杀型脱叶除草剂百草枯,因对人畜有较强毒性,急性中毒病死率极高,已成为实验探讨和临床关注的重点。本实验主要通过力学-生物学手段研究人胚肺成纤维细胞的增殖、粘弹性和CTGF表达,解释百草枯对肺细胞作用的机理,进一步解释肺损伤机理或肺纤维化机制,为进一步探索有效的治疗手段,提供理论指导。实验方法:本实验所用人胚肺成纤维细胞MRC-5购于中科院细胞库。培养于MEM培养基中(内含10%的小牛血清),于恒温恒湿的CO2孵箱内培养,CO2含量5%,温度37℃,并进行传代培养。配制不同百草枯浓度的MEM培养液(含10%小牛血清)-50mg/L、100mg/L、200mg/L备用。收集MRC-5细胞,接种于六孔培养板,待细胞贴壁生长后换含有百草枯的细胞培养液,于恒温恒湿的CO2孵箱内培养,CO2含量5%,温度37℃,12h。12h后换不含百草枯的细胞培养液继续培养。(1)经百草枯处理后的MRC-5细胞换不含百草枯的细胞培养液继续培养24h后,细胞经0.25%胰酶消化5min后制备单细胞悬液,研究百草枯对人肺成纤维细胞增殖的影响。(2)经百草枯处理后的MRC-5细胞换不含百草枯的细胞培养液继续培养,分别于12h、24h、36h、48h、60h、72h收集细胞上清液,离心去杂质后-70℃冷藏备用。采用双抗夹心ELISA法检测人肺成纤维细胞CTGF的表达情况,研究百草枯对人肺成纤维细胞CTGF表达的影响。(3)经百草枯处理后的MRC-5细胞,换不含百草枯的细胞培养液继续培养24h,收集细胞,制成细胞悬液,通过微管吸吮技术检测人肺成纤维细胞的粘弹性,研究百草枯对人肺成纤维细胞生物力学特性的影响。结果:(1)正常MRC-5细胞的增殖活性较高,而经过百草枯处理后,细胞增殖活性明显降低,且培养液中百草枯浓度越大,细胞的增殖活性越低。(2)正常MRC-5细胞分泌少量CTGF,CTGF浓度在0-48h,随时间变化而明显增加(P<0.05),而60h与72h CTGF的浓度与48h无明显差异(P>0.05);50mg/L百草枯处理后,0-36h CTGF浓度有少量表达,无明显差异,48h时CTGF表达明显增加(P<0.05),48-72h CTGF浓度随时间变化而明显增加(P<0.05),在72小时时CTGF浓度有大幅度的提高;100mg/L百草枯处理后,0-36h CTGF浓度有少量表达,无明显差异(P>0.05),48h时CTGF表达明显增加(P<0.05),48-72h CTGF浓度随时间变化而明显增加(P<0.05),在72小时时CTGF浓度有大幅度的提高;200mg/L百草枯处理后,0-48h CTGF浓度有少量表达,无明显差异(P>0.05),60h时CTGF表达明显增加(P<0.05),在72小时时CTGF浓度有大幅度的提高(P<0.05)。(3)经过百草枯处理后MRC-5细胞的粘弹性各项参数均明显小于正常MRC-5细胞(P<0.05),也就是说经过百草枯处理后MRC-5细胞生物力学特性降低,变得较“软”。在经过100mg/L和200mg/L百草枯处理后MRC-5细胞的粘弹性要小于50mg/L百草枯处理(P<0.05),而100mg/L和200mg/L百草枯处理组之间细胞的粘弹性无明显差异(P>0.05)。结论:(1)百草枯处理后,短时间内由于毒性作用,肺成纤维细胞增殖活性降低。(2)肺成纤维细胞在百草枯处理72小时后,CTGF表达分泌大量增加,将促进肺纤维化进程。(3)百草枯处理后的肺成纤维细胞粘弹性降低,表明中毒过程中,细胞骨架发生改变。(4)百草枯中毒改变了肺成纤维细胞正常的生长代谢及骨架结构,提示在中毒早期,可以通过抑制CTGF过表达,修复细胞内部骨架结构等方面进行治疗。