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心血管病(cardiovascular disease,CVDs)是终末期肾脏疾病(End Stage Renal Disease,ESRD)患者最常见的并发症以及最主要的死亡原因,其致死率比其它并发症高10~20倍[1]。而ESRD并发CVDs中又以动脉粥样硬化(atherosclerosis,AS)多见[2]。ESRD患者存在多种导致心血管疾病的危险因素,如吸烟、高血压、糖尿病、肥胖和血脂异常等,但这些传统的危险因素并不能完全解释在ESRD患者并发CVDs特别是AS的高发性和较高的死亡率[3-6],因此,研究AS的病理改变机制对于提高ESRD患者的生存和生活质量十分重要。氧化应激作为重要危险因素在CVDs特别是AS的发病机制中具有重要作用。血管壁ROS的大量产生不仅可导致一氧化氮(nitric oxide,NO)生物利用度降低而引起内皮功能障碍,并且可损伤血管壁结构而促进AS的形成[7,8]。炎症(inflammatory)在AS的形成中的重要作用也不容忽视[9,10]。炎症早期可募集免疫细胞至动脉,晚期可激活动脉壁的T细胞产生并分泌炎性细胞因子,促进炎症的发生发展[11]。有研究表明,高水平尿素可诱发脂肪细胞的氧化应激和功能障碍,引发胰岛素抵抗[12]。ESRD患者体内的血尿素水平会随着肾功能进行性下降而不断增高;高尿素水平是否为诱导血管内皮细胞活性氧簇(reactive oxygen species,ROS)大量产生以及促进炎症发生的重要病理因素,其机制如何?目前尚不清楚。衔接蛋白p66Shc是由原癌基因Shc A编码、广泛表达于哺乳动物细胞内有调节线粒体功能的蛋白,介导了包括高血糖、同型半胱氨酸等多种病理因素所诱导的血管内皮功能失常[13]。而PKCβ是介导p66Shc蛋白磷酸化及其线粒体转位的关键蛋白[14],PKCβ/p66Shc/m Cyt.C复合物的形成在PKCβ介导的细胞氧化损伤中起到关键作用[15]。我们在前期工作中发现高尿素可诱导p66Shc磷酸化水平的增高,那么,高尿素是否通过PKCβ/p66Shc通路诱导ROS的大量产生和炎症的发生?因此,本研究拟采用体外实验验证以上假设。目的:探讨PKCβ/p66Shc通路在高水平尿素引起人脐静脉内皮细胞(human umbilical vein endothelial cells,HUVECs)、ROS和炎症产生中的作用。方法:体外培养HUVECs,分为正常对照组、甘露醇组、尿素组和尿素+PKCβ抑制剂(LY333531)组。采用CCK-8法检测高水平尿素对HUVECs活性的影响,倒置显微镜观察细胞形态的改变;DCFH-DA法检测细胞内ROS含量;免疫荧光技术观察细胞内p-p66Shc、TNFα和ICAM-1的表达;Western blot检测细胞中p66Shc、p-p66Shc、PKCβ、p-PKCβ、TNFα、ICAM-1、i NOS和e NOS的表达水平。结果:1.25mmol/L尿素明显抑制HUVECs活力,引起细胞排列紊乱,细胞间隙增大,铺路石样排列结构受到破坏等形态学改变。2.与对照组相比,25 mmol/L尿素引起细胞内ROS水平明显升高,在6 h达到峰值(P<0.05);加入PKCβ抑制剂LY333531后ROS水平明显降低(P<0.05)。3.25 mmol/L尿素负荷6 h后可见细胞胞浆内p-p66Shc、TNFα和ICAM-1荧光强度明显增强;与此同时,尿素可诱导p-PKCβ、p-p66Shc、TNFα、ICAM-1和i NOS蛋白的表达呈时间依赖性增加,其中p-p66Shc6 h组与对照组相比,升高了约76%(p<0.01),24 h时升高了约2倍(p<0.01);p-PKCβ与对照组相比,24 h时升高了约64%(p<0.05)。TNFα与对照组相比,6 h增加了约40%,24 h增加了约一倍(p<0.05);ICAM-1在6 h增加了约80%,24 h增加了约2倍(p<0.05);i NOS 24h升高了约1倍(p<0.05);e NOS与对照组相比,12 h下降了约34%(图7B,p<0.05),24 h下降了约56%(p<0.01)4.加入LY333531后p-p66Shc、TNFα和ICAM-1荧光强度降低,同时,Western blot结果显示,p-p66Shc、TNFα、ICAM-1蛋白表达下调,p-p66Shc蛋白的表达水平与对照组相比,降低了约40%(p<0.05);与6 h组相比,TNFα减少了约61%(p<0.05);ICAM-1减少了约94%(p<0.01);e NOS与6 h组相比,蛋白表达水平提高了约50%(p<0.01)。结论:PKCβ/p66Shc信号通路是高水平尿素诱导HUVECs内ROS和炎症产生的重要途径。