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一、研究背景与意义短串联重复序列(short tandem repeat,STR),又称为微卫星DNA (microsatellite deoxyribonucleic acid)或简单序列重复(simple sequence repeats, SSRs)。 STR核心序列一般由2-6个碱基构成,因该核心序列在不同个体间呈不同数目的串联重复排列,而呈现出长度多态性。由于片段长度短,扩增效率高,因此,对降解严重的腐败检材或放置时间长的陈旧检材也能成功进行基因分型。目前全世界的司法鉴定DNA实验室都应用该技术作个体识别和亲缘关系分析鉴定。1985年,Jeffreys首次将DNA指纹技术用于实际办案。1986年,我国开始法医DNA分析技术的应用研究,1989年应用于实际检案。检测手段从RELP分析技术到PCR-银染显带分型,虽然这些技术均发挥了重要作用,但与法医实验检案要求相差很大。荧光标记STR复合扩增技术的出现极大拓展了法医DNA检验技术应用范围,已经成为法医物证学主要的检验手段。在没有国产化试剂盒之前,我国DNA实验室日常检案使用的DNA扩增试剂盒主要依靠进口的商品化试剂盒,这些商品化的试剂盒显然有不少优点:结果稳定、可靠,重复性好,但同样有其缺点:价格昂贵,且部分基因座在中国人群中多态性低。公安部物证鉴定中心在“十五”期间,主持研发了DNATyperTM15扩增试剂盒,采用四色荧光技术,同时扩增检测15个基因座(含性别位点)。然而,随着DNA技术的广泛应用和不断发展,15个基因座的试剂盒不能满足检案的需求,主要表现在单次扩增的信息量不足以满足海量DNA数据信息的比对要求,与国外同类产品如美国Promega公司生产的PowerPlex@21扩增试剂盒相比,在个体识别力、扩增效能方面也有差异。为此,公安部物证鉴定中心新近研发了DNATyperTM15Plus扩增试剂盒,可以同时扩增18个基因座,本课题就是通过大样本调查汉-维人群18个基因座的等位基因频率,获得法医学应用参数,为计算该检测系统的个体识别和亲缘鉴定提供基础数据,并通过检测该试剂盒对常见生物检材的检验效能,为法医DNA实验室应用试剂盒提供借鉴。二、研究方法(一)本研究用样本1、广东汉族1500名无关个体血样(滤纸)由广州市公安局刑警支队DNA实验室提供;2、新疆维吾尔族1381份无关个体血样(滤纸)来自喀什,由新疆喀什市公安局在知情自愿的前提下协助采集;3.2800M control DNA,购自美国Promega公司,浓度为10ng/μl。4、广州市公安局番禺区分局DNA实验室受理的检材,经AmpFSTR(?) SinofilerTM扩增试剂盒扩增检验成功后,选择其中的210份,分别为人员口腔拭子60份,现场血迹30份,现场烟蒂30份,硬组织30份(指甲、软骨各15份),混合精斑30份(内裤及阴道拭子),接触性检材30份(其中水杯擦拭、掌纹、衣物各10份)。(二)本研究用方法本研究使用DNATyperTM15Plus扩增试剂盒对广东汉族1500名无关个体及新疆喀什地区维吾尔族1381名无关个体的血样进行检验,采用美国AB公司的9700型PCR扩增仪进行扩增,3130x1全自动遗传分析仪进行检测,使用GeneMapperlD v3.2分析电泳结果,利用powermarker3.25软件,根据基因分型结果分别计算18个STR基因座的基因频率,并对基因频率分布进行X2检验,采用法医学统计软件Powerstats1.2计算非父排除率(Excluding probability of paternity PE),匹配概率(probability of matching Pm),个人识别能力(probability of discrimination DP),多态性信息量(Polymorphism information contents PIC),并计算出18个STR基因座的累积个体识别率(cumulative probability of discrimination CDP)和累积非父排除率(cumulative probability of exclusion CEP),为个体识别、亲权鉴定及群体遗传学提供基础资料。并在上述案件中选取的、采用AmpFSTR(?) SinofilerTM扩增试剂盒检验成功的检材210份,使用DNATyperTM15Plus扩增试剂盒在同一条件下进行扩增,从灵敏度、检出率、准确性、平均峰高及平均峰面积这几个方面来进行比较。三、实验结果(一)广东汉族1500名无关个体的18个STR基因座共发现232个等位基因,其中等位基因最多的基因座为FGA,共23个,最少等位基因的为TPOX,仅7个。18个STR基因座单基因频率在0.0003-0.5407之间,其中频率最高的等位基因为TPOX的等位基因8,为0.5407。18个STR基因的杂合度(heterozygosity H)在0.5920~0.9073之间,个体识别能力DP值在0.790-0.984之间,多态性信息含量PIC值在0.5501-0.9010之间;非父排除率PE值最高为PentaE,为0.810,最小为TPOX,为0.281;18个STR基因座偶合几率为1.33275E-22;累积个体识别力大于99.9999999999999999999%,累积非父排除率约0.999999964。(二)新疆维吾尔族1381名无关个体的18个STR基因座共发现231种等位基因,其中等位基因最多的基因座为Penta E,共22个,最少等位基因的为TH01,仅6个。18个STR基因座的等位基因频率在0.0004-0.5304之间,其中频率最高的等位基因为TPOX的等位基因8,为0.5304。18个STR基因座杂合度(H值)在0.6358~0.9233之间,个体识别能力DP值在0.880-0.988之间,多态性信息含量PIC值在0.5870~0.9180之间;18个基因座总偶合几率为2.3764E-23,累积个体识别能力大于99.99999999999999999999%,累积非父排除率大于0.9999999。(三)DNATyperTM15plus扩增试剂盒与AmpFSTR(?) SinofilerTM扩增试剂盒对常见检材在同一条件下进行检验,从灵敏度、检出率、一致性、等位基因峰高及峰面积方面进行比较。DNATyperTM15plus扩增试剂盒对2800M control DNA模板量在0.313ng~1.25ng之间可以检验成功,并得到很好的基因分型图谱;AmpFSTR(?) SinofilerTM扩增试剂盒对2800M control DNA模板量在0.156ng-1.25ng之间可以检验成功,并得到很好的基因分型图谱。210份检材中,以检出的STR基因座大于或等于9个为成功检出,采用DNATyperTM15plus扩增试剂盒检验的共成功检出187例,检出率为89.05%,采用AmpFSTR(?)SinofilerTM扩增试剂盒检验的共成功检出210例,检出率为100%,其中采用AmpFSTR(?) SinofilerTM扩增试剂盒扩增的检出6例混合斑,而这6例混合斑采用DNATyperTM15plus扩增试剂盒扩增仅检出2例。同一样本在两个试剂盒相同的基因座上的STR分型一致,一致率达到100%。六组检材在18个STR基因座及性别基因座的等位基因平均峰高差异(Sinofiler试剂盒/DNATyperTM15plus试剂盒)在0.97倍-48.05倍之间(仅CSF1PO位点的平均峰高值差异小于1,其他位点均大于1),平均峰面积差异(Sinofiler试剂盒/1DNATyperTM15plus试剂盒)在0.42倍-46.33倍之间(除D21S11、D5S818、 vWA位点的平均峰面积差异小于1,其他位点均大于1);平均峰高与平均峰面积的差异是一致的,互相印证了结果的准确性。四、实验结论1、该18个STR基因座构成的检测系统在汉族人群及维族人群具有高度多态性,可满足该两群体个体识别和亲权鉴定的需要。且两人群的基因分型有显著性差异,表明该检测系统除了法医学应用,在考古学、群体遗传学及人类学等研究方面也有重要的应用价值。2. DNATyperTM15plus试剂盒对210份经Sinofiler扩增试剂盒检验成功的常见检材检验,发现DNATyperTM15plus试剂盒对常见检材能进行准确的基因分型,对模板量在0.313ng-1.25ng之间的扩增可以得到很好的基因分型图谱。3、DNATyperTM15plus试剂盒包括了18个基因座的信息,对于单亲鉴定及无名尸检验更加有利,且为国产试剂盒,价格优势明显。对建库样本(血样)的检验检出率可达100%,可满足建前科库的需求;对常见检材,由于DNATyperTM15plus试剂盒的检出率稍逊于Sinofiler试剂盒,故建议检验新鲜检材、量较大的检材可以优先选择DNATyperTM15plus试剂盒。