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血凝素相关匿名蛋白（thrombospondin related anonymous protein，TRAP）和环子孢子蛋白（Circumsporozoite protein，CSP）是两个重要的的红前期疟疾疫苗候选抗原，我们选取恶性疟原虫（Plasmodium.falciparum P.f）3D7株TRAP膜外区序列（氨基酸26～330）和CSP 19个4肽重复区及其羧基末端序列（氨基酸199～383），将这两个片段通过甘氨酸-脯氨酸-甘氨酸（GPG）接点连接，产生了含有多个免疫功能域的恶性疟原虫融合蛋白4（PfCP-4），并人工全合成了pfcp-4基因。pfcp-4合成基因全长为1577bp，将该基因分成两个片段（pfcp-4a和pfcp-4b）分别合成。采用不对称PCR法将8条寡核苷酸链（长度分别为：120、116、126、125、113、115、118和105 bases）拼接成pfcp-4a DNA片段，再将另外8条链（长度分别为：117、105、132、138、115、119、118和96 bases）拼接为pfcp-4b DNA片段。两个片段分别克隆pBluescript载体进行测序和纠正错误序列。通过PstⅠ切点将两个序列正确的片段连接，产生全长pfcp-4合成基因。 为检测该基因在异源系统中的表达，我们将全合成pfcp-4基因克隆在受异丙基-β-D-硫代半乳糖苷（IPTG）调控的表达载体，再转化大肠杆菌SG13009进行诱导表达，并用抗CSP的免疫血清进行免疫印迹检测。结果显示，在IPTG诱导菌体中检测到约57KDa表达条带，该产物的大小与推算的分子量一致，而在未诱导和空载体菌样品中没检测到特异反应条带。这表明pfcp-4合成基因能在大肠杆菌中产生全长PfCP-4重组蛋白。 本实验室已在减毒伤寒杆菌CVD908疫苗株中建立了四环素诱导表达系统，并能在体内、外有效诱导表达外源基因，通过诱导表达可提高质粒在体内稳定性和表达水平。本研究目标之一是在该系统中诱导表达pfcp-4基因，并通过体内诱导表达检测小鼠产生的免疫应答反应。为此，将pfcp-4基因克隆在受去水四环素（aTc）调控的表达载体PZE11，并电转化入CVD908△aroC::tetR疫苗株进行诱导表达，体外结果显示，经aTc诱导后，该疫苗株能稳定产生57KDa全长目的蛋白，而在非诱导组未见表达条带，表明pfcp-4基因能在CVD908△aroC::tetR疫苗株中产生，并受aTc严格调控。 将表达pfcp-4的伤寒杆菌疫苗株腹腔接种BALB/c小鼠，随后注射aTc进行体内诱导表达，共免疫3次。结果显示，在诱导组小鼠血清产生了明显抗PfCP-4 的特异抗体，而在未诱导组及空载体菌对照组小鼠血清中未检测到特异抗体，表 明携带pfcp－4表达质粒的伤寒杆菌进入体内后，在aTe诱导下表达了PeP－4重 组蛋白，并递呈给宿主兔疫系统产生应答反应。本研究通过基因合成，构建了由 恶性疟原虫hhP和CSP组成的融合抗原基因，并能在人伤寒杆菌疫苗株中实 现体内外诱导表达，兔疫小鼠产生了PfCP－4特异应答反应，这为进一步开展的 减毒伤寒杆菌为传递载体的疟疾红前期疫苗的研制提供必要的基础。