论文部分内容阅读
目的：研究白细胞介素21(IL-21)对外周血来源CIK细胞(细胞因子诱导杀伤细胞)抗白血病的作用及其作用机制。方法：1、采集分离正常人的外周血单个核细胞,加用细胞因子诱导培养CIK细胞。2、构建表达IL-21基因的慢病毒载体,感染CIK细胞并鉴定。3、MTT法检测外源及内源IL-21作用下CIK细胞的增殖能力及杀伤白血病细胞系K562细胞作用。4、流式细胞仪检测外源及内源IL-21作用下CIK细胞免疫表型及其表面IL-21受体(IL-21R)、FasL、细胞内穿孔素和颗粒酶B的表达。5、半定量RT-PCR法检测外源及内源IL-21作用下CIK细胞IFN-γ、TNF-α、 TNF-β、穿孔素、颗粒酶A、颗粒酶B、FasL和NKG2D mRNA的表达。6、酶联免疫法检测外源及内源IL-21作用下CIK细胞培养上清中IFN-γ和TNF-α的表达。7、Western blot法检测外源IL-21作用下CIK细胞JAK-STAT信号途径的变化。结果：1、在外源IL-21作用下：(1)总的细胞数量的扩增无明显变化,CIK细胞的产生由(17.5±4.7)%升至(26.5±2.1)%(P<0.05)。(2)CIK细胞对K562细胞的杀伤作用由(22.8±2.8)%升至(44.6±8.3)%。(p<0.05)(3)CIK细胞表面IL-21R的表达增加约2倍。(4)CIK细胞IFN-γ mRNA的表达升高了经2倍由0.3760±±0.2358升至0.7786±±0.2493(p<0.05),TNF-α mRNA的表达升高约2倍由0.6557±0.1598升至1.3145±0.2136(p<0.05),穿孔素mRNA的表达升高了约1.5倍由0.6361±0.1457升至0.9831±0.1265(p<0.05),颗粒酶B mRNA的表达量升高了近2倍由0.4084±0.1589升至0.7319±0.1639(p<0.05),FasL mRNA的表达升高了约2倍由0.4015±0.2842升至0.7381±0.2568(p<0.05),颗粒酶A、TNF-β和NKG2D mRNA的表达与对照相比差异无统计学意义。(5)对mRNA表达有差异的指标进一步行蛋白表达的检测发现：CIK细胞表面FasL的表达水平加IL-21组(0.19%)与未加IL-21组(0.04%)有明显差异,CIK细胞内穿孔素的表达由35.28%升至53.16%,颗粒酶B的表达由43.16%升至78.82%,培养上清中IFN-γ的表达由(25.8±6.1)ng/L升至(56.0±2.3)ng/L(p<0.05),TNF-α的表达由(5.64±0.61)μg/L升至(15.14±0.93)μg/L(p<0.05)。(6)Western blot结果显示STAT1和STAT5a的表达无明显差异,STAT3和STAT5b的表达增加。2、在内源IL-21作用下：经酶切与测序鉴定,IL-21慢病毒载体构建正确,共转染CIK细胞中有目的基因IL-21的表达。与对照相比：(1)总的细胞数量的扩增无明显变化,CIK细胞的产生由(16.95±4.7)%升至(24.60±2.1)%(p<0.05)。(2)CIK细胞对K562细胞的杀伤作用由(23.28±2.8)%升至(58.42±8.3)%(p<0.05),作用5天后仍能维持在(61.16±6.2)%(p<0.05),相比外源作用由(22.80±2.8)%升至(44.60±±8.3)%(p<0.05),杀伤作用更强,而且作用时间更长久。(3)CIK细胞表面IL-21R的表达增加约2倍。(4)CIK细胞IFN-y和TNF-αmRNA的表达升高了1.5倍多,穿孔素、颗粒酶B、FasL mRNA的表达量升高了近2倍,颗粒酶A、TNF-β和NKG2D mRNA的表达与对照无明显差别。(5)对mRNA表达有差异的指标进一步行蛋白表达的检测发现：CIK细胞表面FasL的表达水平转染IL-21组(0.56%)与对照组(0.06%)有明显差异,CIK细胞内穿孔素的表达由12.23%升至25.86%,颗粒酶B的表达由14.56%升至37.58%, IFN-y的表达由(23.2±5.6)ng/L升至(55.3±3.5)ng/L(p<0.05),TNF-α的表达由(5.65±0.58)μg/L升至(15.62±±0.62)μg/L(p<0.05)。结论：IL-21具有增强CIK细胞抗白血病的作用,IL-21与IL-2具有协同作用,而且内源作用下作用时间更长久,此作用是通过增加其受体的表达,增加穿孔素、颗粒酶B、FasL、IFN-y和TNF-α的表达而实现的。JAK-STAT细胞信号途径的激活是此种作用的机制之一。提示IL-21在增强白血病免疫治疗中具有潜在的临床应用前景。