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背景:Lane等在研究SV-40T抗原与细胞蛋白相互作用时发现p53蛋白。Wtp53基因在细胞正常生长过程中起着重要的调节作用,明显抑制细胞的转化生长。一旦p53基因丢失(deletion)或突变(mutation)便失去对细胞生长的抑制作用,诱发多种癌变。在已检测的人类肿瘤中,50%以上含有p53基因突变。p53蛋白被认为是细胞生长过程中主要的负调控因子,p53调控细胞生长的功能以及肿瘤发生的密切关系使得p53一直处于细胞学与肿瘤研究的“热”点位置。国内外的研究大多集中在通过载体(如病毒载体AAV)将wtp53基因转入到肿瘤细胞中,恢复wtp53蛋白的抑瘤功能。但导入的载体存在不安全性,而利用基因工程体外合成wtp53蛋白,并用磁性纳米粒子修饰后直接作用于肿瘤细胞并探讨其诱导凋亡的机制,国内外尚无此报道。目的:体外合成获得野生型p53蛋白(wtp53蛋白),并观察wtp53蛋白对人早幼粒白血病细胞诱导凋亡作用,旨在阐明wtp53蛋白的抗肿瘤机制。方法:将人wtp53基因cDNA片段插入到大肠杆菌表达载体pGEX-2T中,得到重组表达质粒pGEX-2T-p53;用pGEX-2T-p53重组质粒转化大肠杆菌BL21细胞,转化菌落经PCR扩增和EcoRⅠ,HindⅢ酶切证实p53基因插入。IPTG诱导大肠杆菌表达wtp53蛋白,用SDS-PAGE分离鉴定,再通过GST亲和层析柱纯化。得到较纯的蛋白,并通过磁性纳米粒子表面修饰后用四氮唑蓝比色法(MTT法)及集落形成法观察wtp53蛋白对HL-60细胞生长抑制以及对其生长周期的影响,应用流式细胞术、透射电镜、荧光显微镜等方法检测HL-60细胞凋亡的发生。结果:1.IPTG诱导后的大肠杆菌与对照组比较出现明显的53kD蛋白带。2.修饰过的p53蛋白对HL-60细胞的生长有明显的抑制作用,与对照组相比有显著性差异(p<0.01),且抑制率与用药剂量及时间呈显著性正相关,在剂量为0~100μg/ml范围内,抑制率随剂量的增加而增加。3.p53蛋白诱导HL-60细胞发生凋亡,电镜下观察到HL-60细胞细胞核固缩,核内染色质浓缩、凝聚,紧靠在细胞核膜边沿,形成新月形或环状结构等典型的凋亡细胞的形态变化及凋亡小体。流式细胞仪可检测到。p53蛋白1μg/ml诱导HL-60细胞72h时产生明显的亚二倍体峰;5.AFM观察发现外源p53蛋白出现在细胞质和细胞核内。 结论:这种原核细胞表达的人wtp53蛋白具有天然的p53蛋白的特性,在体外分析时发现p53蛋白能抑制HL-60细胞生长并促使其发生凋亡。 本实验为寻找新型抗肿瘤基因工程药提供可靠的数据和资料