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【目的】探讨TNF-α、GSK-3β及RANKL在糖尿病性骨质疏松症发生发展中的作用。【方法】(1)建立糖尿病骨质疏松大鼠模型:选用雌性SD大鼠,随机分为对照组及实验组,实验组:选取成年雌性大鼠,用高糖高脂饲料喂养8周后,禁食12小时腹腔注射链脲佐菌素(STZ)50mg/kg,一周后重复检查血糖浓度>7.8mmol/L表示糖尿病大鼠造模成功。1周后用10%水合氯醛3.5ml/kg腹腔注射麻醉后,摘除双侧卵巢。继续喂养至12周。同时纳入病程相近的假手术组大鼠作为阳性对照,所有大鼠测每周体重变化,麻醉状态下取血清应用酶联免疫吸附法测定大鼠骨钙素(OC),核因子kb受体活化因子配基(RANKL),糖原合成酶激酶-3β(GSK-3β),P38丝裂原活化蛋白酶(P38-MAPK),肿瘤坏死因子(TNF-α)等细胞因子,留取两组大鼠L6椎体和左股骨等骨标本,进行骨密度分析,HE染色形态学分析,应用多媒体病理图像分析软件进行骨组织形态计量学分析。(2)将实验组及对照组体外培养成骨细胞及破骨细胞,用噻唑蓝比色法(MTT)以及流式细胞仪进行成骨及破骨细胞活性、细胞周期以及凋亡的检测;用酶标仪检测碱性磷酸酶(ALP)活性或免疫组化检测I型胶原表达来测定成骨细胞的分化情况,通过抗酒石酸酸性磷酸酶(TRAP)染色、甲苯胺蓝(TB)染色、检测破骨细胞的分化情况。细胞培养基分别以阴性干预剂、GSK-3β抑制剂,TNF-α拮抗剂和RANKL拮抗剂进行处理,检测骨细胞的增殖、凋亡的变化,用RT-PCR检测GSK-3β、TNF-α、RANKL基因水平在各分组的表达变化。【结果】(1)成功建立糖尿病大鼠骨质疏松模型,8和12周实验组大鼠骨密度明显低于对照组。成功分离培养成骨细胞和破骨细胞。酶联免疫吸附实验表明,糖尿病模型组中RANKL水平,GSK-3β,p38MAPK和TNF-α明显升高,而骨钙素(OC)水平和胰岛素(INS)均显著降低。(2)MTT结果显示成骨细胞的增殖在GSK-3β抑制剂均低于对照组,成骨细胞的增殖在TNF-α拮抗剂组和RANKL拮抗剂组明显高于对照组。破骨细胞的增殖在GSK-3β抑制剂增殖均低于对照组,破骨细胞增殖在TNF-α拮抗剂组和RANKL拮抗剂组非常接近对照组。在所有的相应的组中,实验组骨细胞增殖明显强于对照组。流式细胞仪显示在GSK-3β抑制剂组中,实验组破骨细胞的凋亡率显著低于对照组,在TNF-α拮抗剂组,RANKL拮抗剂组中,实验组破骨细胞的凋亡率显著高于对照组,在GSK-3β抑制剂组,TNF-α拮抗剂组中,实验组成骨细胞的凋亡率显著低于对照组;在RANKL拮抗剂组,实验组成骨细胞的凋亡率和对照组大鼠无显著差异。RT-PCR显示在GSK-3β抑制剂组中,TNF-α和RANKL基因表达水平均升高,但TNF-α和RANKL基因表达水平在实验组中均略低于对照组。GSK-3β基因表达水平在TNF-α拮抗剂和RANKL拮抗剂组降低;GSK-3β基因的表达水平在实验组明显低于对照组。【结论】1、实验性糖尿病大鼠卵巢切除成功建立糖尿病骨质疏松大鼠模型。糖尿病模型组中RANKL水平,GSK-3β,p38MAPK和TNF-α明显升高,而骨钙素(OC)水平和胰岛素(INS)均显著降低。2、在糖尿病模型大鼠中,TNF-α,GSK-3β和RANKL水平较对照组升高;GSK-3β可以促进成骨细胞和破骨细胞的增殖,并抑制TNF-α和RANKL的表达;TNF-α和RANKL对破骨细胞的增殖影响不大,抑制成骨细胞的增殖;还能促进GSK-3β表达;三者之间的相互作用,打破了成骨细胞和破骨细胞之间的平衡,参与了骨质疏松症的发生发展。