【摘 要】
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γ-氨基丁酸(γ-aninobutyric acid,GABA)是哺乳动物中枢神经系统中广泛分布的最重要的抑制性神经递质。GABA_B受体属促代谢型受体(metabotropic receptor),也称G蛋白耦联受体(
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γ-氨基丁酸(γ-aninobutyric acid,GABA)是哺乳动物中枢神经系统中广泛分布的最重要的抑制性神经递质。GABA_B受体属促代谢型受体(metabotropic receptor),也称G蛋白耦联受体(G protein-linked receptor)。GABA_BR的大部分生理功能都与它通过G蛋白对电压敏感型钙通道和钾通道(Kir)的调节有关。在本研究中我们大量培养含有pET28c质粒的BL21(DE3),表达的融合蛋白GABA_BR碳端带有His组氨酸的标签,用于融合蛋白的亲和分离纯化。最佳IPTG诱导浓度为1mM,最佳诱导温度为37℃,最佳诱导时间为3h。在37℃1mM IPTG诱导3h,重组大肠杆菌1mL菌液约含GABA_BR蛋白70μg,但是目的蛋白主要以包涵体表达。对包涵体蛋白进行初步洗涤纯化,然后用5M盐酸胍,8M尿素分别溶解。在变性条件下(5M盐酸胍)经分子筛柱进行层析纯化,得到电泳纯的蛋白,纯度可达95%以上。然后,采用稀释复性,复性效率为70.6%。我们还采用了逐步透析的方法对电泳纯的包涵体蛋白进行复性,在变性条件下(5M盐酸胍)于4℃分别对100mL盐酸胍浓度依次为4M-3M-2M-1M-0M的透析液进行透析,复性效率为26%。我们也采用了柱上复性的方法对包涵体进行复性,在变性条件下(8M尿素)依次以含有6M-5M-4M-3M-2M-1M-0M尿素的refolding buffer的缓冲液洗柱,复性效率约为40%,此方法可实现蛋白的同时纯化及复性。
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