目的：阿尔茨海默氏病(Alzheimer’s disease)是临床的常见病,多发病。至今没有有效的治疗药物。细胞外β淀粉酶(Aβ)过度沉积是AD的一个标志性病理产物。而且越来越多的证据显示,自噬在Aβ代谢和AD发病中发挥一定的作用。我们近期发现,一种丁内酯衍生物3BDO可以抑制细胞内自噬泡聚积并保护细胞免受Aβ的细胞毒性作用。在此,我们利用一种成熟的阿尔茨海默氏病(AD)动物模型——APP/PS1双转基因小鼠,研究丁内酯衍生物3BDO对Ap代谢的作用,长期抑制自噬对AD的影响,从而探讨3BDO在治疗AD中的作用。以期为我们研究治疗和预防AD提供了有益的参考。方法：1.3BDO为脂溶性药物。将3BDO溶于DMSO中,浓度为200mg/ml。2.用6月龄APP/PS1双转基因小鼠为模型,分为三组。采用微量注射器腹腔注射的方式给药。对照组(腹腔注射NaCl),溶剂对照组(腹腔注射DMSO),实验组,腹腔注射3BDO。注射剂量为80mg3BDO/kg小鼠体重,每只小鼠每天注射一次。平均每只小鼠注射药物量为10ul。注射持续10周。3.采用morris水迷宫进行小鼠的行为学检测。全过程包含1天适应期(没有平台),5天寻找隐藏平台的学习实验,以及学习实验24小时后,外加一天的探索实验。在学习实验中,每一次实验,小鼠游泳寻找隐藏平台的时间最多为60s。如果在60s内,小鼠没有找到平台,则将小鼠引导到平台上。每只小鼠每天训练4次。平台位置在SW西南象限,起始位置为N(north)、E(east)、 SE(southeast)、NW(northwest)。每天随机使用该四个位置的一个位置,以防止小鼠不是根据平台位置去找寻平台,而是根据特定的左右转向定位平台位置。动物找寻并爬上平台的时间被定为潜伏期。最后一次学习实验结束后24h,移除平台进行探索实验,用以检测记忆能力。探索实验中,采用新的起始位置(东北),而且每次实验的时间为60s。在探索试验中,动物穿越原先平台的位置次数,被用来评估学习任务的优劣。所得数据采用重复数据的方差分析和多元方差分析。4.用硫磺素硫及免疫组化的方法,观察小鼠脑片老年斑沉积的数量及面积。用Elisa定量分析脑内的Aβ40及Aβ42的含量。综合二者结果,确定3BDO治疗之后,APP/PS1小鼠脑内的老年斑数量及Ap的含量变化。5.采用免疫印记Western blot定量观测小鼠脑内与自噬有关的蛋白(LC3-Ⅰ, LC3-Ⅱ,自噬底物蛋白P62等)的含量变化,同时检测与自噬相关的mTOR信号的底物分子——磷酸化的P70的含量,来确定3BDO对自噬及mTOR信号的影响。同时用透射电镜观察小鼠皮层中神经元中的自噬泡数量。来共同确定3BDO对小鼠脑内自噬水平的影响。6.采用免疫印记Western blot定量观测小鼠脑内与Aβ代谢相关性最大的β分泌酶及Aβ降解酶的含量变化。同时检测Aβ的前体物质——APP的含量。BACE1是剪切生成Aβ的关键酶,而NEP(neprilysin)、IDE(Insulin degradation enzyme)是两个最关键的Aβ降解酶。联合分析APP、BACE1、NEP、IDE的变化,可以探索3BDO导致Aβ减少的相关机制。采用抗体免疫捕获的方法将降解酶NEP、IDE从组织液中分离出来,通过激活特异性荧光底物Mca-RPPGFSAFK-OH的量来检测NEP与IDE的活性。结果：1.注射后动物无死亡,各组之间体重没有明显差异。说明3BDO具有良好的安全性。2.3BDO改善了APP/PS1小鼠的学习和记忆能力。在8月龄时,水迷宫实验发现,APP/PS1小鼠已经具有明显的学习和记忆损害。而经过3BDO处理的转基因小鼠,学习和记忆能力则明显提升。相对于对照组,实验组(3BDO)小鼠潜伏期明显缩短,而探索实验中穿越平台的次数和花在平台所在象限的时间,均明显增加。这提示3BDO治疗可以明显改善APP/PS1小鼠的学习和记忆能力缺陷。3.3BDO治疗明显减少了APP/PS1转基因小鼠脑内淀粉样斑块的形成和可溶性Ap的水平。结果发现,实验结束后,8月龄小鼠脑内均观察到了明显的Aβ沉积。与对照组相比,3BDO治疗后,明显降低了APP/PS1转基因小鼠海马和皮层的Aβ沉积。通过ELISA试剂盒定量检测全脑可溶性Ap的含量发现,相对于对照组,治疗组的Aβ40和Aβ42水平均明显减少。这说明3BDO减少了APP/PS1小鼠脑内的Aβ水平。4.自噬3BDO抑制了APP/PS1小鼠脑内的自噬水平,而抑制自噬是经由激活mTOR蛋白实现的。WB结果发现,3BDO治疗后,相对于对照组而言,LC3-Ⅱ的量明显减少。与此相应的是,自噬底物P62的含量则升高了。这表明长时间的3BDO治疗抑制了APP/PS1小鼠脑内的自噬流。通过检测mTORC1磷酸化激活底物p70S6K(P70)的含量发现,相对于对照组(DMSO和NaCl),3BDO治疗明显增加了p70的含量,因此,这意味着3BDO是通过激活mTOR途径而抑制了自噬。通过透射电镜计数神经元内自噬泡的含量,我们也发现,3BDO治疗明显减少了神经元内自噬泡的数量,改善了神经元的功能。5.3BDO治疗增加了转基因小鼠脑内NEP和IDE的水平。3BDO治疗后,APP/PS1小鼠脑内的APP的表达量、β分泌酶BACE1的含量,以及β分泌酶剪切APP生成的C-末端产物,均没有明显改变。然而,两个Aβ降解相关的酶,NEP和IDE,在3BDO治疗后,均明显增加了。而且NEP酶的活性增加也非常明显。这提示我们,3BDO治疗后APP/PS1小鼠脑内Aβ含量的降低很可能是源于Aβ降解的增高所致。结论：综上,我们在此进一步探讨了3BDO治疗能否阻止或者延迟转基因小鼠的AD进展。我们发现,长时间3BDO治疗提高了Aβ降解酶IDE和NEP的含量,增加了NEP酶的活性,抑制了自噬水平(通过mTOR途径),减少了脑内Aβ的含量,改善了APP/PS1痴呆小鼠的行为学表现。而且,治疗期间未见动物死亡,说明3BDO具有一定的安全性。因此,我们的实验结果证明了,长时间应用3BDO对与治疗AD具有有益的作用。这对研究自噬的生物学功能和在AD中的潜在机制,以及治疗AD都可以提供一个良好的工具。