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辣椒(Capsicum annuum L.)是一种重要的蔬菜作物和调味品，具有较高的营养和药用价值。然而，由于各种病虫的危害，辣椒的产量和品质受到严重的影响。其中，病毒病是辣椒生产中的主要病害之一，但是目前没有一种很有效的农药可以防治，最好的解决方法就是通过基因工程来选育抗病品种。 在以前的蔬菜基因工程研究中，多是将单一基因导入受体植株，获得的转基因植株只有一个外源基因。如果同时将2个导入到受体蔬菜中，则更好。 本实验将缺失无毒型商陆抗病毒蛋白基因PamPAP克隆到含有Bt抗虫基因Cry2Aa2和非抗性标记基因PMI的植物表达载体上，利用农杆菌将其转入辣椒中，经过PMI/甘露糖筛选体系筛选后，对转基因植株进行了分子检测和功能验证，从而获得抗虫、抗病毒病，同时又对人体和环境安全的转基因辣椒材料。主要研究结果如下： 1.植物表达载体pCAMBIA1301-Cry2Aa2-PamPAP-PMI的构建设计特异性引物从商陆中克隆PamPAP，连接到pMD19-T上后将其命名为pMD19-PamPAP。再将质粒pBI121的表达盒插入到载体pCAMBIA1301-Cry2Aa2-PMI上，并将其命名为pCAMBIA1301-A。最后将载体pCAMBIA1301-A和pMD19-PamPAP用Xba I和BamH I同时进行双酶切，回收后将PamPAP插入到pCAMBIA1301-A上，最终获得双价表达载体为pCAMBIA1301-Cry2Aa2-PamPAP-PMI。 2.辣椒再生体系及遗传转化体系的建立本实验探讨了不同基因型、外植体类型、不同甘露糖浓度等对辣椒不定芽再生的影响，从而建立了以Flamingo-bill外植体为主的高效遗传转化体系：用9～12 d的辣椒无毒苗制备Flamingo-bill外植体(将无菌苗的一侧子叶从叶柄基部连同顶芽及周围分生组织全部切去，只留一侧子叶)，在预培养基(MS+5.0 mg/L BA+1.0mg/L IAA+0.5mg/L GA3+5.0 mg/L AgNO3)上暗培养2 d；用OD600值为0.4～0.8的菌液浸染12min后，置于预培养基上共培养2～3 d；然后转到抑菌培养基(预培养基+200mg/L Cef)上培养4～5 d；再转入筛选分化培养基(MS+5.0mg/L BA+1.0mg/L IAA+0.5mg/L GA3+5.0mg/L AgNO3+5％椰乳+200 mg/L Cef+18mg/L甘露糖+12mg/L蔗糖)中培养，每两周继代一次。获得抗性芽后转入伸长培养基(MS+1.0mg/L ZT+1.0mg/LIAA+200mg/L Cef+3.0mg/L AgNO3+1.5mg/L GA3+18g/L甘露糖+12g/L蔗糖+5％椰乳)中伸长。芽伸长后转到生根培养基(MS+0.1mg/L IAA+0.2mg/L NAA+200mg/L Cef+18mg/L甘露糖+12mg/L蔗糖)中生根，最终获得60株抗性苗。 3.转基因植株的分子检测提取60株T0代转基因植株的DNA，并进行PCR检测，结果只有10株均能扩增出PamPAP和Cry2Aa2的目的条带，PCR阳性率为16.7％，转化率大约为0.3％。对PCR检测呈阳性的植株进行Southern杂交，结果表明检测的2株均为阳性。从而表明外源基因已经整合到辣椒基因组DNA中。再提取PCR检测呈阳性的转基因植株的RNA进行RT-PCR检测，结果表明10株能扩增出PamPAP和Cry2Aa2的目的条带，说明这两个基因在转录水平上进行共表达。 4.转基因植株的功能鉴定对RT-PCR检测呈阳性的T0转基因植株进行人工接种CMV，接种50 d时调查辣椒品种Ⅰ和Ⅱ的病情：接种CMV的转基因植株病情指数分别为15.6和13.3；接种CMV的非转基因植株病情指数分别为82.2和86.7；未接种CMV的非转基因植株生长正常。结果说明转基因植株对CMV表现为高抗。 通过抗虫检测表明取食转基因植株叶片幼虫的校正死亡率要明显高于阴性对照，并且体重在明显下降，对叶片的损害程度较轻，说明转基因辣椒植株对斜纹夜蛾幼虫具有明显的抗性。