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目的:(1)在细胞水平敲低长链非编码RNA H19(Imprinted maternally expressed transcript),研究对HL60细胞(急性髓性白血病细胞)生物功能(增殖、凋亡、侵袭、迁移)的影响,为探索靶向诊治某些类型AL(acute leukemia,AL)提供分子基础依据。(2)研究H19可能作用的下游效应分子,探索靶基因启动子区CpG岛的甲基化修饰情况,从而阐述H19对HL60细胞作用的初步机制。方法:(1)运用RNAi干扰技术,构建pGV248-H19-RNAi-GFP、Puro慢病毒干扰载体,转染HL60细胞。(2)在慢病毒成功转染HL60细胞并取得较高的转染率后,分别用CCK-8法,克隆形成法、流式细胞仪检测敲低H19对HL60增殖的影响。(3)采用苯并咪唑荧光染料(bisbenzimide,Hoechst33258)染色法观察细胞凋亡的形态、流式细胞术检测细胞的凋亡率、蛋白印迹法检测细胞株中凋亡相关蛋白Caspase-3、Caspase-8和Caspase-9的表达,使用上述方法研究细胞凋亡情况。(4)使用Transwell小室探究H19对HL60侵袭、迁移能力的影响,测量穿膜细胞的OD值以反映穿膜细胞数,从而验证对侵袭、迁移的影响。(5)通过文献检索,筛选H19下游可能调节的靶基因,敲低H19后在细胞水平上用RT-qPCR检测相关靶基因的表达变化情况,同时检测可能作用的下游效应分子的表达水平,并通过蛋白印迹法检测靶基因蛋白和下游效应分子表达蛋白的状况。最后在细胞水平采用焦磷酸测序法检测H19敲低后靶基因启动子区CpG岛的甲基化修饰情况,比较si-H19组、si-NC组的靶基因的甲基化率,从而阐述H19对HL60细胞生物功能影响的初步机制。结果:(1)成功构建GV248-H19-RNAi慢病毒载体,转染HL60细胞株,采用RTqPCR检测到HL60细胞中H19表达下调,且有统计学意义,可为后续实验提供基础。(2)在慢病毒成功转染HL60细胞并取得较高的转染率后,分别用CCK-8法,克隆形成法、流式细胞仪检验敲低H19后对HL60细胞的增殖能力的影响,显示:敲低H19可显著抑制HL60细胞的增殖,并在G0/G1期阶段发生阻滞,S期下降。(3)Hoechst 33258荧光染色显示:敲低H19后,HL60细胞中部分细胞核致密浓染,有些细胞核裂解为碎块,并生出凋亡小体,出现凋亡形态改变;流式细胞仪检测细胞凋亡率,结果显示HL60细胞出现凋亡率明显增高的现象;凋亡相关蛋白Caspase-3、Caspase-8、Caspase-9表达增加。(4)Tanswell小室法检验敲低H19对HL60细胞侵袭和迁移能力的影响,结果:穿膜细胞数无明显差别,差异不具有统计数意义,敲低H19对HL60细胞的侵袭能力、迁移能力无明显影响。(5)通过阅读相关文献,推测H19可能调控的1个靶基因:RB基因,此基因根据已有研究为抑癌基因。(6)敲低H19后,RT-qPCR检测可能作用的下游效应分子DNMT1基因、DNMT3A基因、DNMT3B基因的表达量均出现不同程度的下调,而可能作用的靶基因RB出现上调。(7)敲低H19后,Western-blotting法检测相关蛋白的表达,HL60细胞表达的DNMT1蛋白、DNMT3A蛋白、DNMT3B蛋白下调,RB蛋白上调。这和RTqPCT结果相一致。(8)敲低H19后HL60细胞中RB基因启动子区CpG岛的甲基化率出现下降。结论:(1)体外实验敲低H19,可抑制HL60细胞的增殖,发生G0/G1期的阻滞,S期下降同时可促进细胞发生凋亡,并有可能通过激活Caspase凋亡蛋白相关通路诱导细胞凋亡。(2)Tanswell实验检测敲低H19对HL60细胞侵袭和迁移能力的影响,结果表明穿膜细胞数无明显差别,差异不具有统计数意义,敲低H19对HL60细胞的侵袭和迁移能力无明显影响。(3)检索相关文献资料,推测H19可能调控的1个靶基因:RB基因,此基因根据相关文献为抑癌基因。(4)敲低H19后HL60细胞中RB基因启动子区CpG岛的甲基化率呈现下降。(5)H19影响HL60细胞生物功能的可能作用机制为:通过影响下游效应分子DNMT1、DNMT3A、DNMT3B的表达从而诱导下游RB基因的启动子区CpG岛低甲基化率,从而调控RB基因高表达,最后影响HL60细胞的生物功能。