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第一部分视网膜前体细胞的培养和鉴定目的：分离和培养不同时期的RPCs并鉴定。方法：分离E14和E18 SD大鼠的RPCs，用改进DMEM/F12无血清培养基悬浮培养并在体外诱导分化，倒置相差显微镜每天观察细胞的生长和分化情况，免疫细胞化学、扫描电镜和透射电镜对RPCs进行鉴定。结果：RPCs在DMEM/F12无血清培养基中悬浮成球，贴壁后，细胞逐渐从细胞球向周围迁移分化。扫描电镜可见细胞球和分化细胞的形态，透射电镜可见细胞球内存在RPCs样细胞，贴壁后形成神经元样和神经胶质样细胞。免疫细胞化学显示悬浮培养的细胞球中大部分细胞表达神经外胚层源性干细胞标志Nestin和细胞分裂增殖标志BrdU，贴壁后，RPCs能分化为多种视网膜细胞类型，包括Thy1.1阳性的RGCs。E14和E18 RGCs％分别为16.91％±4.05％和4.65％±1.88％，两组比较，差异有统计学意义（t=15.04，P＜0.001）。结论：改进DMEM/F12无血清培养基可成功培养RPCs，培养的RPCs具有无限增殖和多向分化潜能。早期RPCs向RGCs分化的百分比较高第二部分眼内微环境对视网膜前体细胞向视网膜神经节细胞分化的影响目的：研究视神经钳夹伤模型对RPCs向RGCs分化的影响。方法：成年雄性SD大鼠，随机选取左右眼进入试验，试验组为视神经钳夹伤模型，对照组暴露视神经，但不钳夹。分离培养E14 SD大鼠的RPCs，用BrdU标记后分别移植到试验组和对照组的玻璃体腔，于移植后1w，2w，4w取眼球，免疫细胞化学检测移植细胞的迁移、整合和分化情况。结果：对照组移植的RPCs主要位于宿主玻璃体腔，随着时间的推移，未见明显的迁移和分化。试验组移植的RPCs逐渐向宿主视网膜各层迁移，其中位于内层视网膜的细胞数量明显多于外层视网膜，以GCL为最多，随着时间的推移，外层视网膜的细胞数量逐渐增多，但仍明显少于内层视网膜。免疫细胞化学显示试验组位于宿主视网膜不同层的移植细胞表达不同的视网膜细胞特异性标志，Thy1.1阳性的细胞主要位于GCL，其次是INL。结论：视神经钳夹伤模型能诱导RPCs迁移到GCL并向RGCs分化。第三部分Muller细胞对视网膜前体细胞向视网膜神经节细胞分化的作用目的：研究Muller细胞和MCM在RPCs向RGCs分化中的作用。方法：分离培养P7 SD大鼠的Muller细胞，E14和E18 SD大鼠的RPCs，分别将不同时期的RPCs单独培养（Muller（-）组），与Muller细胞共同培养（Muller（+）组），用MCM诱导分化（MCM组）。倒置相差显微镜每天观察细胞的生长和分化情况，Thy1.1标记RGCs并计数。结果：不同时期，不同培养条件下的RPCs都能分化为多种视网膜细胞类型，包括Thy1.1阳性的RGCs，但RPCs向RGCs分化的百分比不同。E14，Muller（-）组，Muller（+）组和MCM组RGCs％分别为16.91％±4.05％，47.25％±9.67％和42.36％±10.52％，E18则分别为4.65％±1.88％，9.90％±3.19％和8.69％±3.01％。Muller（+）组、MCM组与Muller（-）组比较，差异有统计学意义（P＜0.001）。Muller（+）组与MCM组比较，差异无统计学意义（P＞0.05）。E14，Muller（-）组和MCM组RPCs增生细胞％分别为32.13％±6.11％和57.07％±9.31％，E18则分别为31.51％±6.32％和56.18％±8.79％，MCM组与Muller（-）组比较，差异有统计学意义(tE14=12.28，P＜0.001；tE18=12.49，P＜0.001)。结论：Muller细胞能促进RPCs的增殖和RPCs向RGCs的分化，可能通过Muller细胞释放某些可溶性因子发挥作用。第四部分Notch-1调控视网膜前体细胞向视网膜神经节细胞分化目的：研究Notch-1对RPCs向RGCs分化的调控作用。方法：分离培养E14 SD大鼠的RPCs，试验组和对照组分别用含有Notch-1反义寡核苷酸链和无关序列寡核苷酸链的分化培养液进行诱导分化，倒置相差显微镜每天观察细胞的生长和分化情况，Thy1.1标记RGCs并进行计数。结果：试验组和对照组的RPCs都能分化为多种视网膜细胞类型，包括Thy1.1阳性的RGCs，但两组RPCs向RGCs分化的百分比不同。试验组和对照组RGCs％分别为16.57％±4.31％和31.19％±6.90％，两组比较，差异有统计学意义（t=9.84，P＜0.001）。结论：Notch-1对RGCs的分化具有负向调控作用，阻断Notch-1能促进RPCs向RGCs分化。第五部分Math5调控视网膜前体细胞向视网膜神经节细胞分化目的：研究Math5对RPCs向RGCs分化的调控作用。方法：分离培养E14 SD大鼠的RPCs，构建Math5-EGFP质粒，以EGFP质粒作为对照，转染RPCs，倒置相差显微镜每天观察转染后RPCs的生长和分化情况，重点观察其向RGCs的分化，Thy1.1标记RGCs并进行计数，同时用荧光定量RT-PCR的方法检测RPCs分化不同时间点Math5相关基因的表达情况。结果：Math5-EGFP／EGFP质粒能成功转染RPCs，转染效率为24.68％。转染后的RPCs仍能分化为多种视网膜细胞类型，包括Thy1.1阳性的RGCs。A组（Math5质粒转染组），B组（空质粒转染组）和C组（未转染质粒组）RGCs％分别为30.85％±6.28％，15.84％±3.55％和16.22％±3.60％，A组与B组、C组比较，差异有统计学意义（P＜0.001）。Math5相关基因Delta-1、Hes1和Brn-3b在RPCs分化的不同时间点表达不同，Math5-EGFP质粒转染RPCs不仅改变Delta-1、Hes1和Brn-3b基因的表达量，而且改变其表达曲线。结论：Math5对RGCs的分化具有正向调控作用，过量表达Math5能促进RPCs向RGCs分化，并伴随相关基因的变化。