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低温是限制冷敏感植物产量和地理分布的重要因素。生物膜是低温伤害的初始位点。植物的抗冷性与膜脂中脂肪酸的不饱和程度密切相关。由于叶绿体中磷脂酰甘油(PG)的sn-2位主要被饱和脂肪酸或反式不饱和脂肪酸所占据,因而PG在sn-1位的顺式不饱和脂肪酸水平决定了植物的抗冷性。决定PG中sn-1位顺式不饱和脂肪酸含量的是叶绿体甘油-3-磷酸酰基转移酶(GPAT: EC2.3.1.15)对底物的选择性。GPAT是PG生物合成过程中的第一个酰基脂化酶,它将脂肪酰转移到3-磷酸甘油的sn-1位上合成1-酰基-Sn-甘油-3-磷酸(溶血磷脂酸)。来源于抗冷性不同的植物的GPAT对底物酰基具有不同的选择性。一般来说,抗冷植物中GPAT优先选择C18:1-ACP作为底物,因此在这些植物中PG的sn-1位上就含有较高比例的18:1脂肪酸,这些脂肪酸可以在酰基脂肪酸去饱和酶的作用下进一步去饱和化成为顺式多聚不饱和脂肪酸;然而在冷敏感植物中,GPAT很难区分C18:1-ACP和C16:0-ACP,由于16:0脂肪酸不能被进一步去饱和形成顺式不饱和脂肪酸,结果这些植物中PG的sn-1位顺式不饱和脂肪酸含量较低,从而表现为冷敏感。本研究从番茄叶片中分离到叶绿体甘油-3-磷酸酰基转移酶基因,并对该基因的表达和功能进行了分析。主要结果如下:1.利用同源序列设计简并引物,通过RT-PCR的方法从番茄叶片克隆到甘油-3-磷酸酰基转移酶基因的中间片段,通过5’-RACE和3’-RACE分别克隆到5’和3’片段,拼接后设计特异引物扩增到全长cDNA,命名为LeGPAT (DQ459433)。该基因全长为1770 bp,ORF为1314 bp,编码437个氨基酸,分子量约为48 kDa。同源序列比较发现,番茄甘油-3-磷酸酰基转移酶基因的序列与甜椒、红花、豌豆、菠菜的甘油-3-磷酸酰基转移酶基因的序列同源性较高。结构同源性分析表明LeGPAT有四个序列保守的结构域,block I的组氨酸和天冬氨酸残基,block III的甘氨酸残基和block IV的脯氨酸残基都是绝对保守的,它们组成了一个重要的催化位点。2.将p35S-LeGPAT-GFP融合蛋白在豇豆原生质体中瞬时表达。通过Confocal观察到GFP激发的绿色荧光和叶绿素的红色自发荧光完全重合,说明LeGPAT的基因产物定位于叶绿体。3. Northern杂交分析显示,LeGPAT在不同器官中呈非特异性表达,在叶绿素含量高的组织中表达量较高。同时,该基因在4-40℃的温度范围内均有表达,且受低温诱导,高温胁迫抑制其表达。4.将获得的LeGPAT与含有35S启动子的pBI121载体重组,分别构建了正义和反义表达载体,利用农杆菌介导的叶盘法转化番茄,用PCR和Northern杂交的方法对带卡那抗性的转基因番茄植株进一步检测,获得了转正义和反义基因的番茄植株。与野生型植株相比,过量表达LeGPAT的番茄叶片类囊体膜PG中18:2和18:3含量明显增加,脂肪酸不饱和度升高,从而导致低温胁迫下转基因植株类囊体膜的流动性高于野生型植株。LeGPAT表达发生沉默的番茄植株中PG的18:2和18:3含量下降,而16:0,16:1和18:0含量增加,脂肪酸饱和度升高。5.构建了原核表达载体pET-LeGPAT,并在大肠杆菌BL21中表达融合蛋白,免疫小白鼠,制备抗体,其抗血清效价为1:500。Western杂交表明,转正义植株中LeGPAT已在蛋白水平过量表达。6.将野生型和转正义基因番茄的酶提取液,以及原核表达后纯化的蛋白分别与[1-14C]18:1-CoA,[1-14C]16:0-CoA,甘油-3-磷酸,HEPES-NaOH缓冲液和BSA反应测定甘油-3-磷酸酰基转移酶的选择性和该酶的活性。结果表明,尽管番茄是冷敏感植物,但甘油-3-磷酸酰基转移酶对18:1的选择性明显高于16:0,且转正义基因番茄的酶含量和总活性高于野生型。7.在低温弱光(4℃,100μmol m-2 s-1)胁迫条件下,野生型和转正义基因株系T1-5和T1-19的光合速率(Pn)都降低,但野生型的降低较明显,并且T1-5和T1-19的Pn可以在12 h内恢复,而野生型的Pn在12 h时仅恢复了73.2%,在24 h时恢复了86.4%。在低温胁迫过程中,T1-5和T1-19的光系统II最大光化学效率(Fv/Fm)降低的程度比野生型小,而且恢复较快,恢复8 h时T1-5和T1-19的Fv/Fm完全恢复,但此时野生型的Fv/Fm只恢复了95.2%。在低温弱光处理过程中,转正义基因植株与野生型的氧化态P700都降低,且区别不大,而转正义基因植株的氧化态P700恢复较快。经过24 h的恢复,T1-5的氧化态P700恢复了98.5%,T1-19的恢复了99.4%,而野生型的只恢复了85.3%;经过12 h的低温胁迫,T1-5和T1-19的相对电导率分别增加到21.3%和19.3%,而野生型的增加到24.4%。转正义基因植株和野生型的NPQ及(A+Z)/(V+A+Z)都增加,但转正义基因植株的NPQ和(A+Z)/(V+A+Z)增加的较多。野生型番茄的叶绿体SOD和APX活性在胁迫的最初6 h升高,随后降低,而转正义基因植株的叶绿体SOD和APX活性在处理9 h后才轻微的降低。低温处理6 h后,转正义基因植株的SOD和APX活性高于野生型。野生型番茄的O2和H2O2的含量在低温处理6 h后开始增加,而转正基因植株的O2和H2O2含量在处理9 h后才增加,而且野生型的O2和H2O2含量增加的程度明显高于转基因植株。胁迫结束时,T1-5,T1-19和野生型的O2含量分别增加了15.7%,14.8%和63.0%,而H2O2含量分别增加了26.0%,15.8%和77.6%。8.反义介导的LeGPAT的缺失能够影响番茄的育性。从形态上看,转反义基因株系(-)12的花粉粒大部败育。(-)12株系从小孢子母细胞时期绒毡层开始败育,在单核小孢子液泡期败育的花粉粒明显高于野生型。反义介导的LeGPAT的缺失能够减少内质网的合成,改变油脂的大小。当花粉粒在培养基上萌发60 min后,野生型的花粉有65%的萌发,而转反义基因株系(-)12的花粉仅有8%的萌发。当花粉粒在培养基上萌发120 min后,野生型花粉的萌发率几乎为100%,而(-)12株系的仅为20%。转反义基因株系(-)12中53.8%(14/26)的花败育,而野生型植株中仅有7.8%(4/51)的花败育。转反义基因植株的种子败育,失去再生能力,而野生型的种子发育正常。9.在高温弱光胁迫(45℃,100μmol m-2 s-1)下处理6 h和12 h,野生型和转反义基因番茄的放氧速率都降低,但野生型降低的比较明显。45℃处理6 h后,野生型,(-)7和(-)12株系的放氧速率分别降低到初始值的30.5%,47.4%和50.9%;12 h时分别降低到7.2%,18.5%和19.4%。高温胁迫过程中,野生型和转反义基因番茄的Fv/Fm都降低,但野生型降低的比较明显。45℃下处理12 h,野生型,(-)7和(-)12株系的Fv/Fm分别降低了42.5%,30.9%和26.8%。上述结果表明,LeGPAT的表达受低温诱导,被高温胁迫抑制。番茄叶绿体甘油-3-磷酸酰基转移酶对18:1的选择性明显高于16:0,且转正义基因番茄中该酶的含量和总活性高于野生型番茄。过量表达该基因可提高番茄植株的耐冷性,而抑制该基因表达可增强番茄植株的耐热性,影响番茄的育性。