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研究背景：副溶血弧菌(Vibrio Parahaemolyticus，Vp)是一种嗜盐性弧菌，可引起食物中毒、反应性关节炎和心脏疾病，副溶血弧菌引起的食物中毒在细菌性食物中毒占的比例很高，发病呈世界性分布，并呈上升趋势，我国沿海地区每年都有因副溶血弧菌引起食物中毒的报道。目前研究认为副溶血弧菌的主要致病因子是其产生的多种溶血毒素，不耐热溶血毒素(thermolabile hemolysin，TLH)是其产生的毒素之一，研究表明副溶血弧菌无论是临床分离株，还是环境分离株都含有tlh基因，且具有种属特异性，国外研究利用tlh基因对副溶血弧菌进行监测和检测，但对其功能和致病性研究的相对较少，国内未见相关研究报道，目前对TLH的功能和致病性仍不清楚。 研究目的；本研究旨在利用编码TLH毒素的tlh基因在副溶血弧菌存在的广泛性和种属特异性，克隆tlh基因，构建原核融合表达载体，纯化获得具有生物活性功能的TLH，对其功能、致病性和免疫原性等方面进行研究。 研究方法： 1．以副溶血弧菌国内标准株Vp14-90基因组DNA为模板，扩增tlh基因，构建克隆载体pGEM-tlh，酶切及PCR分析鉴定。 2．将PCR产物tlh14-90进行序列测定，利用Internet国际互联网上的有关生物信息网站对tlh14-90基因进行生物信息分析。 3．利用基因工程技术，构建融合表达载体pET32a-tlh，转化宿主菌第一军医大学硕士论文DE3，IPTG诱导表达，通过酶切、PCR、SDS一PAGE电泳及Western一blot分析鉴定。 4.优化诱导表达条件，用强变性剂尿素溶解以包涵体形式存在的表达产物，亲合层析纯化目标蛋白。 5.采用逐步透析的方法复性纯化蛋白，获得了具有生物活性功能的蛋白TLH14一90，通过溶血功能的研究、兔肠结扎实验、兔小肠病理改变的研究、溶血抑制实验、耐热实验、ELIsA、w七stem七lot等对TLH功能、致病性和免疫原性进行研究。 研究结果: 1.利用PCR技术扩增了t lh基因(t lhl4一90)，全序列大小为1257bp，有启动子和终止密码子，含有一个418个密码子构成的开放阅读框架 (ORF)，与国际标准株WPI的t lh基因同源性较高(99%)。t lh14一90测序结果被GeneBank收录，登录号为AY289609。 2.生物信息分析结果表明tlh14一90编码418个氨基酸，分子式为CZ: 31凡lo4N*oe4oSI。，分子量47.3929kDa，理论等电点pl为4.92，疏水性强，与SWISS一PROPT中收录TLH(WPI)序列同源性为99%，据TLH14一90氨基酸序列，预测其二级折叠结构可能为Q/口蛋白。 3.通过优化表达条件，PET32a+一tlh在大肠杆菌DE3可稳定高效表达融合蛋白，分子量约为63KDa，表达的融合蛋白存在于胞质中以包涵体的形式存在，占菌体蛋白的10%以上，融和蛋白含有的6xhis有利于下一步蛋白的纯化工作。 4.用强变性剂尿素溶解包涵体，融合表达蛋白含有的6 x Hls，使用6xHIs组氨酸蛋白质镍亲和层析树脂亲和层析纯化目的蛋白。在纯化体系中引入低浓度的咪哇、p一琉基乙醇、Tritonx一100和选择最适结合、洗脱速度有效减少杂蛋白，保证了纯化目的蛋白的纯度(99%)。 5.将蛋白稀释至较低的浓度，采用逐步透析的方法，逐步去除变性剂，在复性体系中加入稳定复性中间体的低浓度表面活性剂SDS和通过疏基氧化形成正确的分子内二硫键的氧化还原剂(氧化型谷肤甘肤和还原型谷耽甘肤)，整个试验操作在低温下进行，防止蛋白降解维持蛋白的生物副溶血弧菌不耐热溶血毒素的克隆、表达、复性及功能的研究活性，通过以上措施获得了具有生物活性的蛋白。 6.对复性蛋白的研究表明该毒素为卵磷脂依赖的溶血毒素，该毒素在卵磷脂存在下才具有溶血活性，不耐热，60℃，10min失去溶血功能，该毒素具有肠毒性，具有一定的免疫原性和保护性抗原作用。 结论: 1.在国内首次克隆、测定了副溶血弧菌不耐热溶血毒素tlh基因。克隆测定了我国标准株vP14一90不耐热溶血毒素tlh基因，t lh14一90测序结果被GeneBank收录，登录号为AY289609，填补了国内相关资料的空白。 2.生物信息分析表明tlh14一90基因全长1257bP，含有启动子和终止密码子，与国际标准株WPI的tlh基因同源性较高(99%)。预测其编码418个氨基酸，分子式为C2131H3184N54:侃。S，。，分子量47.3929kDa，理论等电点PI为4.92，疏水性性强，预测其二级折叠结构可能为a/口蛋白，与SWISS一PROPT中收录TLH(WPI)序列同源性为99%。 3.构建了原核重组表达质粒pET32a一业，诱导表达产物为以包涵体形式存在的融合蛋白，含有6xhis，分子量约为63KDa。 4.通过亲合层析纯化和逐步透析复性方法，获得具有生物活性功能的蛋白，该毒素为卵磷脂依赖的溶血毒素，不耐热，有肠毒性，具有较强的免疫原性，免疫动物后产生的抗体具有一定的中和毒素的作用，可抑制其溶血活性，融合蛋白含有的6xHIs组氨酸似乎不影响其功能，为进一步深入研究TLH的功能奠定了基础。