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目的:本试验首先人工感染绵羊肺炎支原体(MO)得到绵羊肺炎支原体病例,然后用巴什拜羊和盘羊杂交羊重组SPLUNC1蛋白治疗感染MO的盘羊杂交羊,再用ELISA和real-time q PCR的方法,测定IL-5、IL-6、IL-8、IL-9、IL-12和IL-13细胞因子的血清含量和口腔后上腭(咽喉部)上皮组织中SPLUNC1 m RNA的表达水平,以研究重组SPLUNC1蛋白对盘羊杂交羊的免疫调节和治疗效果。方法:(1)SPLUNC1基因的表达和蛋白的纯化:利用课题组已构建好的巴什拜羊和盘羊杂交羊重组GS115/p PIC9K-SPLUNC1巴斯德毕赤酵母阳性克隆菌株,甲醇诱导表达96 h,采用Phenyl sepharose FF树脂进行疏水层析纯化,SDS-PAGE方法检测表达和纯化结果。(2)重组SPLUNC1蛋白对感染MO的盘羊杂交羊相关细胞因子的调节作用:6只巴什拜羊为A组,18只盘羊杂交羊随机分为B、C、D组,全部人工感染MO,每天观察临床症状并记录体温,两周后用ELISA试剂盒检测MO抗体,以验证是否感染MO。从感染第5 d开始,C、D组分别气管注射巴什拜羊和盘羊杂交羊重组SPLUNC1蛋白,150μg/只,每天1次,A、B组气管注射等量生理盐水。分别在第0 d、2 d、5 d、7 d、14 d和21 d采集全部羊的颈静脉血,分离血清,用ELISA方法检测血清中IL-5、IL-6、IL-8、IL-9、IL-12和IL-13的浓度。(3)重组SPLUNC1蛋白对感染MO的盘羊杂交羊的内源SPLUNC1 m RNA水平的影响:在感染前(第0 d)和感染后(第5 d)和治疗后(第21 d),刮取口腔后上腭(咽喉部)上皮组织样品,用real time-q PCR方法检测SPLUNC1 m RNA的表达水平。(4)重组SPLUNC1蛋白对感染MO的盘羊杂交羊的治疗作用:对C、D组连续气管注射巴什拜羊和盘羊杂交羊重组SPLUNC1蛋白,至第21 d,每天测量体温,观察临床症状,试验结束后剖检试验羊,观察肺部变化并照相,取肺组织制作病理切片,采用支原体肺炎组织病理学评分系统,对全部试验羊肺组织病理切片进行病理学评分,评价重组SPLUNC1蛋白的治疗效果。结果:(1)甲醇诱导表达重组GS115/p PIC9K-SPLUNC1巴斯德毕赤酵母阳性克隆株,收集96 h上清液,SDS-PAGE电泳显示有目的条带。重组SPLUNC1蛋白纯化后,SDS-PAGE电泳显示出巴什拜羊25.53 k Da和盘羊杂交羊25.96 k Da的单一目的条带。(2)人工感染MO两周后,所有试验羊MO抗体ELISA检测结果均为阳性,说明全部羊感染了MO。各试验组相关细胞因子变化如下:A组IL-5水平在感染后第14~21 d极显著低于B组(P<0.01;P<0.01),显著低于C、D组(P<0.05;P<0.05);在第21 d,C、D组极显著低于B组(P<0.01)。C、D组IL-6在感染后第14~21 d极显著低于B组(P<0.01;P<0.01),A组极显著低于B组(P<0.01;P<0.01)。IL-8水平在第14~21 d,C、D组显著和极显著低于B组(P<0.05;P<0.01),A组极显著低于B组(P<0.01;P<0.01)。B组IL-9水平在感染后第7 d极显著高于A、C、D组(P<0.01),在第14~21 d C、D组显著和极显著低于B组(P<0.05;P<0.01),A组极显著低于B组(P<0.01;P<0.01)。IL-12水平在第7 d,A组显著低于B组(P<0.05);14 d时C、D组显著和极显著低于B组(P<0.05;P<0.01),A组极显著低于C、D组(P<0.01);第21 d,C、D组极显著低于B组(P<0.01)。IL-13水平在感染后第5 d,A组显著低于B、C、D组(P<0.05);在第7 d,B组显著高于A、C、D组(P<0.05);在第14~21 d,C、D组极显著低于B组(P<0.01;P<0.01);在第21 d,A组显著高于C、D组(P<0.05),显著低于B组(P<0.05)。(3)在感染后,各组试验羊的SPLUNC1 m RNA水平均升高,C、D组在治疗后SPLUNC1 m RNA水平极显著高于B组(P<0.01;P<0.01);A组SPLUNC1 m RNA水平也极显著高于B组(P<0.01)。(4)A组试验羊2~3 d体温一过性增高(40~41℃),之后体温逐步恢复正常,剖检肺组织有出血点;B组体温升高明显(41~42℃),严重咳嗽、腹泻,剖检发现肺表面有结节和肝变;C组经巴什拜羊重组SPLUNC1蛋白治疗后咳嗽、腹泻等症状缓解,剖检发现肺表面有出血点和出血斑;D组注射盘羊杂交羊重组SPLUNC1蛋白后,其临床症状减轻,剖检发现肺部有出血斑。各组试验羊肺组织病理评分结果分别为,A组8.8分,B组18.7分,C组13.2分,D组14分,C、D组显著低于(P<0.05)B组,A组极显著低于B组(P<0.01)。结论:成功表达了巴什拜羊和盘羊杂交羊重组SPLUNC1基因,采用Phenyl sepharose FF树脂疏水层析纯化出了单一目的条带,目的条带大小分别为25.53k Da和25.96k Da。C、D组经巴什拜羊和盘羊杂交羊重组SPLUNC1蛋白治疗后,血清中IL-5、IL-6、IL-8、IL-9、IL-12及IL-13的浓度与B组相比有明显变化,说明两种重组SPLUNC1蛋白对感染MO的盘羊杂交羊相关细胞因子有调节作用。各组羊SPLUNC1 m RNA水平结果说明,重组SPLUNC1蛋白对感染MO的盘羊杂交羊内源SPLUNC1 m RNA水平有一定促进作用。剖检及病理切片评分结果表明,以上两种重组SPLUNC1蛋白对感染MO的盘羊杂交羊均有一定的治疗作用。