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着丝粒(centromere)是真核细胞染色体/质主缢痕上的一个高度特化的区域,在中期时动粒(kinetochore)位于其表层。着丝粒既是染色体与纺锤体相连接的部位,又参与细胞周期中纺锤体检验点,在有丝分裂和减数分裂中起着关键作用。但着丝粒是染色体的小部分,同时结构精细复杂,目前了解较清楚的动粒上的核心复合物是KMN网络(K:Kn11;M;Mis12复合物;N:Ndc80复合物),但着丝粒的组分和结构仍然很不清楚。
我们采用串联亲和纯化(TAP)技术寻找着丝粒上稳定的蛋白复合体。构建了pcDNA-TAP-CENP-K/-P/-Q真核表达质粒,并转染筛选到了它们的稳定表达细胞株。pcDNA-TAP-CENP-K的非同步化和中期同步化细胞中的TAP纯化结果表明:CENP-K-CENP-H在间期(非同步化)和中期细胞(中期同步化)中都是极稳定的蛋白复合体。经预测CENP-K和CENP-H都是潜在的Coiled-coil蛋白,这很可能是它们稳定相互作用的基础,因此我们根据预测构建了CENP-K和CENP-H片段的GST和His标签质粒,拟在体外和体内确定其相互作用区域。
第二部分研究中我们结合胸腺嘧啶类似物的特征(能长期在子代细胞中传递)和间期细胞核中被标记染色体可进行计数的特点提出了在原位长时间追踪细胞增殖代数和细胞增殖速度的方法。并在体外细胞中建立模型验证方法的可行性。结果表明:被“稀释”后的被标记染色体可以通过间接免疫荧光进行识别计数;虽然存在染色体交换,但在经过多于a=log22n代次后ChLI(ChromosomeLabelingIndex)可以很好的反映细胞的增殖趋势。此方法不需要多次取样,适用于比较永生化细胞、癌细胞、体内组织的平行样品之间的细胞增殖代数和速度,并且尤其适合不宜多次重复取样的实验。
第三部分研究中我们发现N-磷酰α-氨基酸在水相温和条件下可与肽或蛋白质反应使其增加一个氨基酸残基。利用合成的短肽与N-磷酰α-氨基酸反应,以串联质谱和液相色谱-质谱联用为分析手段,发现加入的残基位于肽链的N端,并且该残基来源于N-磷酰α-氨基酸。该反应可能的反应机理是N-磷酰α-氨基酸形成五元环五配位磷中间体作为成肽键反应的结构基础,多肽N端氨基亲核进攻该中间体羰基碳原子形成肽键。