论文部分内容阅读
大豆异黄酮是从大豆中提取的一种植物雌性激素，具有天然抗氧化性、预防癌症、保护心血管和防止骨质疏松等多种生理活性。大豆异黄酮主要以无活性的糖苷形式存在，需经人体肠道中微生物产生的β—葡萄糖苷酶水解为活性苷元才能被吸收进入体内发挥作用，但酶数量有限，导致生物利用度很低。本论文旨在利用无载体固定化技术制备高活性和高稳定性的交联β-葡萄糖苷酶聚集体，为大豆异黄酮活性苷元的生产提供基础。本研究在参考Sheldon小组的研究基础上，以黑曲霉β-葡萄糖苷酶为研究对象，将游离β-葡萄糖苷酶用硫酸铵沉淀后，以戊二醛作交联剂对其进行化学交联，制备新型的交联β-葡萄糖苷酶聚集体，并对影响交联酶聚集体活性的主要因素进行单因素考察，确定了交联β-葡萄糖苷酶聚集体的制备条件为：聚集条件：0.34U／ml的β-葡萄糖苷酶液在溶液体系pH值为7.0以及冰水浴条件下，经90％饱和度的硫酸铵沉淀30min，可获得比较理想的β-葡萄糖苷酶聚集体。交联条件：β-葡萄糖苷酶聚集体以5％戊二醛水溶液于30℃下交联150min，再经离心、洗涤数次后即得交联β-葡萄糖苷酶聚集体，其酶活回收率可达77.4％。酶学性质研究表明，交联β-葡萄糖苷酶聚集体的最适温度、最适pH值和Km值分别为60℃、pH4.0和4.61×10-3mol／L。与游离酶的对照实验表明，交联β-葡萄糖苷酶聚集体显示出了更强的热稳定性、pH稳定性、贮存稳定性和对底物的亲和力。对交联β-葡萄糖苷酶聚集体进行电镜扫描显示，其表面疏水性高且糖基化程度低，结构紧密，颗粒呈球状形式，直径约为800nm左右，每个交联酶聚集体中约包含4×106个β-葡萄糖苷酶分子；对β-葡萄糖苷酶聚集体交联前后的结构进行红外光谱分析表明，交联β-葡萄糖苷酶聚集体中存在较多的由氨基与醛基反应形成的酰胺键，验证了β-葡萄糖苷酶聚集体通过戊二醛的交联作用，形成结构紧密的交联酶聚集体。将制备的交联β-葡萄糖苷酶聚集体用于合成大豆异黄酮活性苷元染料木素，对染料木苷水解转化率约为66％。重复使用10批次后，交联酶聚集体对染料木苷仍能保持35％左右的转化效率，表明其具有良好的使用稳定性。