四氢嘧啶在酶制剂、生物医药及护肤品等行业具有广泛的应用前景,目前四氢嘧啶只能通过生物法合成。本课题的目的在于:分离筛选以四氢嘧啶为主要相容性溶质的中度嗜盐菌,研究低渗/高渗冲击对分离菌株胞内四氢嘧啶分泌与合成的影响,探究分离菌株以小分子有机酸及餐厨垃圾厌氧发酵水解液为碳源合成四氢嘧啶的可行性。从江苏省连云港市某地盐池土中富集分离得到一株以四氢嘧啶为主要相容性溶质的中度嗜盐菌W2。根据其形态学特征、生理生化特性和16S rDNA序列同源性分析结果,菌株W2被初步鉴定为盐单胞菌属内的一个种(Halomonas sp.W2)。通过摇瓶实验研究了菌株W2生长和合成四氢嘧啶的最适条件。结果显示,菌株W2的最适生长条件为:温度35℃、起始pH7.0~8.0、NaCl浓度100g/L、装液量≤200 mL/500 mL、接种量≥10%、C/N比≤7:1。菌株W2合成四氢嘧啶的最适条件为:温度 35°C、起始 pH 6.0~8.0、NaCl 浓度 100~125 g/L、装液量 ≤ 200 mL/500 mL、接种量1%或者≥ 20%、C/N比≤ 7:1。在最适生长的盐浓度下,菌株W2单位质量细胞中四氢嘧啶的合成量达161 mg/g cdw,是一株较高产的产四氢嘧啶菌株。在不同盐浓度下培养的W2菌体细胞内均检测到甜菜碱、四氢嘧啶、谷氨酸和天冬氨酸4种相容性溶质。盐浓度对各相容性溶质的相对含量有显著影响,在较低的盐浓度下(25 g/L)各相容性溶质的比例依次为甜菜碱(60.8%)、四氢嘧啶(10.5%)、谷氨酸(16.4%)和天冬氨酸(12.3%),在较高盐浓度的条件下(50~100 g/L),各相容性溶质的比例依次为四氢嘧啶(70.8~85.9%)、甜菜碱(10.7~16.1%)、谷氨酸(1.6~8.8%)和天冬氨酸(1.8~4.2%),说明在不同渗透压条件下菌株W2耐盐生长的机理是不同的:在较低盐条件下主要靠甜菜碱来维持细胞内外的渗透压平衡,而在高盐条件下主要依赖四氢嘧啶以抵御高渗透压的冲击。菌株W2在低渗冲击液中能快速释放四氢嘧啶,在高渗培养基中则能再合成四氢嘧啶,这说明W2菌株是一株分泌型菌株。低渗冲击的最适盐浓度为30 g/L,在此浓度下,四氢嘧啶的释放率为59.7%,再次转入盐浓度为100 g/L的高渗培养基中,胞内四氢嘧啶含量恢复至最高水平(161 mg/g cdw)仅需3 h。上述低渗/高渗冲击条件适用于以乙酸、丙酸、丁酸、乳酸为碳源培养的菌体,但在较高菌体浓度下(5 g/L cdw左右),适当延长低渗/高渗冲击时间才能达到最高的释放率或合成量。在以乙酸、丙酸、丁酸和乳酸为碳源的培养基中,W2菌体能耐受11轮高渗/低渗反复冲击,且高渗冲击时可恢复胞内四氢嘧啶,四氢嘧啶的释放量保持相对稳定,在第12轮冲击时,四氢密啶的合成量和释放量明显下降。经12轮冲击,W2菌体合成四氢嘧啶的总量分别为7.99、9.03、8.58和7.95g/L,释放量分别为:4.33、4.47、4.60和4.15 g/L,释放率分别为:54%、49%、52%和54%。在以模拟餐厨垃圾水解液培养基中,W2菌体也能耐受11轮高渗/低渗循环冲击,且高渗冲击时可恢复胞内四氢嘧啶,四氢嘧啶的释放量保持相对稳定。在第12轮冲击时,四氢嘧啶的合成量和释放量明显下降。经12轮冲击,四氢嘧啶的合成总量分别为10.13、10.8和9.53 g/L,释放量分别为5.09、5.21和5.09 g/L,释放率分别为50%、48%和53%。上述结果证明,以有机酸或模拟餐厨垃圾水解液为碳源通过细菌泌乳法合成四氢嘧啶是可行的。