论文部分内容阅读
菲为一种广泛分布于自然环境的三环芳烃，能导致人类呼吸系统和皮肤的病变，可诱发鱼类和其它生物的突变、畸变与癌变。目前虽未发现其与人类癌症发生的直接相关性，但它含有多环芳烃中与“三致”关系密切的化学结构——K-region和Bay-region，因此成为多环芳烃污染研究的模式化合物。对菲生物降解的研究，不仅有助于环境中菲污染的消除，还可帮助人们了解其它多环芳烃的降解机制及生物降解的可行性，为多环芳烃及石油污染环境的生物修复提供相应的理论依据和治理措施。 本研究分离选育了3株菲降解细菌菌株，并研究了其中一株降解性能异常突出的分离菌株的生长特性、菲降解影响因素、降解途径及部分的相关酶基因。实验结果分述如下： 1、本研究从石油污染土壤中分离到3株菲降解细菌（ZX4、ZX6和EVA17），它们都能以菲为唯一碳源和能源生长。经鉴定3菌株都归于鞘氨醇单胞菌属（Sphingomonas），其中ZX4菌株为少动鞘氨醇单胞菌（Sphingomonas paucimobolis），ZX6菌株为溶芳烃鞘氨醇单胞菌（Sphingomonas aromatics），EVA17菌株比较独特，尚未能鉴定到种。3菌株中，ZX4菌株的生长和菲降解性能最好，在14d中对培养基中含量为1000mg·L-1菲的降解率可达98.7％。 2、ZX4菌株的最适生长温度为35℃。培养基初始pH对ZX4菌株生长和菲降解的影响比较特殊：培养基初始pH6时，与初始pH7相比，ZX4菌株的生长较好，但对菲的降解在2d后便基本停滞，不利于菲的彻底降解；培养基初始pH为6时，随着培养基中菲含量的增加，ZX4菌株的生长出现底物饱和现象，Tween-80的加入对其生长呈抑制效应；而初始pH为7时，ZX4菌株的生长和菲降解速率始终随着菲含量的增加而增大，Tween-80的加入对其生长和菲降解速率都有显著促进作用。氮源NH4NO3、（NH4）2SO4、NaNO3和（NH4）2HPO4对ZX4菌株生长的影响差异不大，但氮源为（NH4）2SO4时菲的降解更为迅速。酵母膏、蛋白胨和葡萄糖等有机物的加入都可不同程度地促进ZX4菌株的生长和菲降解。与菲的单基质培养相比，多环芳烃萘、菲的共基质培养不仅促进了ZX4菌株的生长，且提高了其对菲的降解速率；与ZX4菌株的纯培养相比，菲降解菌株ZX4、EVA17的混培虽然对整体生物量的影响不大，却可明显提高培养基中菲的降解速率。此结果显示，共基质培养和多种菌株的混培在PAHs污染的生物修复中可能更为有效可行。 3、ZX4菌株的降解底物广谱性研究结果显示，ZX4菌株能以儿茶酚及水杨酸为唯一碳源微生物学硕士论文摘要和能源生长，而不能以邻苯二甲酸为唯一碳源和能源生长。前人的研究表明，菲在细菌中的代谢有2种不同途径:一为邻苯二甲酸途径，另外一条为水杨酸途径。其中邻苯二甲酸为前一途径的中间代谢产物;儿茶酚和水杨酸则是后一途径的中间代谢产物。ZX4菌株能利用儿茶酚和水杨酸，却不能利用邻苯二甲酸，这表明其很可能是通过水杨酸途径来降解菲。另外在ZX4菌株中检测到了儿茶酚2，3一双加氧酶的活性，这基本上可确定zX4菌株中拥有菲的水杨酸降解途径，至于其细胞内是否含有其它的菲降解路径还有待于进一步研究。此外，菲诱导前后，全细胞蛋白电泳检测和儿茶酚2，3一双加氧酶的诱导性分析结果均表明，ZX4菌株的菲降解酶系为诱导型酶系，只在需要时才大量表达，其中儿茶酚2，3一双加氧酶主要存在于胞内。 4、利用PCR扩增技术，从ZX4菌株中克隆出了儿茶酚2，3一双加氧酶基因（cZJ口一ZX4），对该基因进行了序列测定和分析，并比较了其与GenBank中已登陆的相关基因的同源性关系。编码该酶的基因间差异较大，没有与之完全一致的基因序列，尽管Zx4菌株的1 65 rDNA序列与助人ingom口nas paucim口bolis的同源性最高，其它的鉴定结果也支持这一结论，但与c2了。一zx4基因同源性最高的却是来自于助几.yanoikuyae BI和助人万馆口monas sP.KMG425的砂您基因，其同源性分别高达94.37%和94.05%。将c23o一ZX4基因在E. coli BLZI进行了成功表达，初步检测结果显示，重组菌株的酶表达量要明显高于出发菌株。