肝细胞癌(简称肝癌)是常见恶性肿瘤，预后差，其5年生存率通常不超过5％。预后差的原因之一是多数患者未能做到早期诊断和早期治疗，而早诊早治是改善肝癌预后最重要因素这一观点已被公认。 甲胎蛋白(alpha-fetoprotein，AFP)是唯一广泛使用的肝癌诊断血清标记物，然而约三分之一的肝癌患者不伴有血清AFP升高，在肿瘤直径小于5厘米的小肝癌患者伴有血清AFP升高的比例更低。另外15—58％的慢性肝炎患者和11—47％的肝硬化患者可伴有AFP水平的非特异性升高，而75—90％的肝癌发生在硬化的肝脏。因此，迫切需要寻找有较高特异度和灵敏度的新肝癌早期诊断标记物，这对AFP阴性肝癌和小肝癌患者尤为重要。 一、用基因芯片技术筛选肝癌组织中高表达基因 为此目的，本课题使用基因芯片分析技术对218例肝癌患者的基因表达谱进行了分析。通过对高AFP水平(AFP≥300ng／ml)肝癌患者和低AFP水平(AFP＜300ng／ml)肝癌患者的基因表达谱比较分析，寻找在肝癌患者中，包括那些AFP阴性(AFP≤20ng／ml)肝癌患者和低AFP水平(AFP＞20-＜300ng／ml)肝癌患者中高表达的基因。经过比较分析，得到46个在肝癌患者肿瘤组织中平均表达水平大于等于2的基因。随后对这46个基因进行比较分析和筛选，选择的标准主要有：1)这些基因在肝癌组织中，包括那些AFP阴性和低AFP水平的肝癌组织中高表达；2)这些基因编码的蛋白质为分泌性蛋白或者比较新，可能在血清中或者血浆中发现并进行定量分析。据此标准，在46个高表达基因中选择了5个基因进行下一步的验证和分析，这5个基因分别是：GPC3，PEG10，MDK，SERPINI1和QP-C。 二、用实时定量PCR分析技术进行验证分析 随后，应用实时定量PCR分析技术对这5个基因分别在50例AFP阴性和8例AFP阳性的肝癌组织、10例肝癌患者癌旁无瘤肝硬化组织以及26例单纯肝硬化患者肝脏组织中的相对表达水平进行了分析和验证，发现这5个基因在大多数肝癌组织，包括那些AFP阴性的肝癌患者，小肝癌患者肿瘤组织中的表达水平显著升高。这5个基因：GPC3，PEG10，MDK，SERPINI1和QP-C在肝癌组织中的平均相对表达水平分别为26.9，23.8，40.2，6.2和4.8；而在肝硬化肝脏组织中的平均相对表达水平分别为0.2，0.2，1.4，1.1和0.8，所有5个基因在两组间的表达水平都有显著性差异(p＜0.0001，nonparametric Mann Whitney tests)。对这5个基因在58例肝癌组织和36例肝硬化组织中的表达情况进行分析，按照每个基囚在36例肝硬化组织中的平均表达水平加上2倍的标准差(M+2SD)来计算该基因的正常表达水平阈值，然后在肝癌组织和肝硬化组织中统计表达水平高于该正常阈值的病例数和百分比，结果显示65.5％—84.5％的肝癌组织5个基因表达水平高于阈值，而在肝硬化组织中表达水平高于阈值的仅为2.8％—5.6％。 用PAM(Prediction Analysis of Microarray)软件对其表达数据作进一步分析，这5个基因作为潜在诊断标记物在肝癌组织中的诊断预测准确率为84.5％(49／58)，在AFP阴性的肝癌患者中的诊断预测准确率为82％(41／50)，在小肝癌患者中的诊断预测准确率为87.5％(35／40)。依据这5个基因的差异表达可以准确地将肝癌组织(84.5％，49／58)和肝硬化的肝脏组织(100％，36／36)区分开。 根据实时定量PCR分析结果和PAM软件分析结果，发现GPC3，PEG10和MDK在其中起主要作用，其所占预测权重较大。此外，对5个基因的不同组合方式诊断预测分析准确性进行分析后发现由于这些肝癌诊断标记物之间可以有互补作用，因此多个诊断标记物联合应用可以增加其诊断预测准确性。 三、血清标本midkine酶联免疫吸附分析 目前已知GPC3，MDK和SERPINI1编码的产物是存在于血清中的已知蛋白质。由于目前仅MDK编码的蛋白质midkine有已经开发好的酶联免疫吸附分析(ELISA)试剂盒，故用ELISA试剂盒对另外64例肝癌患者和26例正常人血清标本中midkine的浓度进行了测定，发现在肝癌患者中血清midkine水平中位数(25％和75％位数)为442.8(288和666.5)pg／ml，而正常人血清中midkine水平中位数(25％和75％位数)仅为11.65(3.83和42.3)pg／ml，两组间血清midkine水平有显著的统计学差别(p＜0.0001，unpaired t test with Welch’s correction)，在肝癌患者中，包括那些AFP阴性的肝癌患者[中位数(25％和75％位数)为445.6(381.9，673.4)pg／ml]和小肝癌患者[中位数(25％和75％位数)为392.1(250.9，549.3)pg／ml]，血清midkine水平比正常人显著升高。 按照在26例正常人血清中midkine浓度的平均值加上2倍的标准差(M+2SD)来计算其正常表达水平阈值，然后在肝癌病例和正常人中统计midkine浓度高于该正常阈值的例数和百分比，结果100％(64／64)的肝癌病例其血清midkine浓度高于阈值，而在正常人则仅有7.7％(2／26)高于阈值。 而对不同AFP水平肝癌病例进行分组并对其血清midkine水平进行比较分析，发现在AFP阴性肝癌(AFP≤20ng／ml)、低AFP水平(20ng／ml＜AFP＜300ng／ml)肝癌和高AFP水平(AFP≥300ng／ml)肝癌病例组的血清midkine水平无显著差异(p=0.96，one-way ANOVA)。依据肿瘤直径大小对肝癌病例进行分组并对其血清midkine水平进行比较分析，同样发现在肿瘤直径＜3cm的肝癌病例、3cm≤肿瘤直径≤5cm的肝癌病例和肿瘤直径＞5cm的肝癌病例组的血清midkine水平无显著差异(p=0.22，one-way ANOVA)。 根据肿瘤大小将64例肝癌病例分为两组，肿瘤直径小于5cm的小肝癌组(29例)和肿瘤直径大于等于5cm的大肝癌组(35例)，对这两组肝癌病例血清中AFP和midkine水平进行比较分析。大肝癌组血清AFP水平中位数(25％和75％位数)为1634(21.85和41910)ng／ml，小肝癌组AFP水平中位数(25％和75％位数)为74.3(11和477)ng／ml，两组间的AFP水平有显著差异(p=0.02，nonparametric Mann Whitney tests)，提示肝癌病例的血清AFP水平与肿瘤大小相关；而大肝癌组血清midkine水平中位数(25％和75％位数)为553.1(373.3和682.8)pg／ml，小肝癌组血清midkine水平中位数(25％和75％位数)为392.1(250.9和549.3)pg／ml，两组间血清midkine水平无显著统计学差异(p＞0.05，nonparametric Mann Whitney tests)。因此，肝癌病例血清AFP水平的高低可能反映肿瘤大小，而不同肿瘤大小的肝癌病例其血清中midkine水平均显著升高，且无显著差异。由于小肝癌患者其血清AFP水平相对较低，诊断特异性较差，我们可以利用其血清midkine水平来进行AFP阴性肝癌病例和小肝癌的早期诊断。 本研究的结果表明，这5个基因作为新的潜在肝癌早期诊断辅助标记物，对肝癌患者，包括那些AFP阴性肝癌，低AFP水平肝癌和小肝癌患者具有较高的灵敏度和特异度，值得进一步深入研究。如将其与AFP联合应用在肝癌诊断和肝癌手术治疗后的随访中，可以提高肝癌患者，尤其是AFP阴性的肝癌患者，低AFP水平肝癌患者及小肝癌患者的早期诊断率和诊断准确率，使更多肝癌患者能够做到早诊早治，以进一步改善肝癌预后。