目的：　　 子宫内膜异位症（endometriosis，EMs，简称内异症）是常见的妇科疾病，以子宫内膜的异位生长为特征。内异症作为一种良性疾病却有恶性行为，其发生与机体的免疫功能密切相关，由于在位内膜的某些特性，分泌某些细胞因子使机体局部免疫功能逐渐减退，子宫内膜细胞如同肿瘤细胞一样可能发生免疫逃逸，局部对异位内膜细胞的特异性免疫减弱，免疫监视和清除异位细胞能力下降，使异位内膜得以种植、生长。　　 根据细胞因子可将机体细胞免疫分为两种状态:Th1免疫状态，以分泌白细胞介素2(IL-2)、γ干扰素(IFN-γ)和肿瘤坏死因β(TNF-β)等为主;Th2免疫状态，以分泌IL-4，-5，-6，-9，-10，-13和-17A等为主。T-bet/GATA3是两种转录因子，分别调节辅助T细胞(Th细胞)Th1/Th2亚型的分化，来控制机体的免疫状态，二者异常与恶性肿瘤发生密切相关Podgaec等的研究显示，内异症患者体内Th1/Th2平衡状态破坏，Th2因子表达增强，Th1因子表达受抑制，且随着内异症临床分期的增加，这种变化更加明显。　　 T-bet为T-box家族的新成员，其基因位于人17号染色体上。T-bet在维持Th1细胞因子和抑制Th2细胞因子合成中发挥了关键作用。Th1细胞的特征性细胞因子是IFN-γ及IL2，二者均与内异症发生发展密切相关，说明通过对Th1类细胞因子的调节，T-bet可能会影响内异症的发生与发展。　　 GATA3是1993年发现的一种锌指蛋白。GATA3对Th2细胞分化的作用首先被Zheng和Flavell确定，Th2类细胞因子主要包括IL-4，-5，-6，-9，-10，-13等，其异常表达是导致内异发生发展的重要机制。因此GATA3作为这些细胞因子表达上调的起动因子，可能对内异症发生与发展存在作用。　　 T-bet/GATA3在调节细胞因子的同时，还与雌孕激素高度相关。目前尚无T-bet/GATA3在内异症中功能研究的报道。内异症具有的类似于恶性肿瘤的特性，在内异症的发生发展中具有关键作用，而这些特性恰与T-bet/ GATA3失衡导致的Th1/Th2状态倾斜而引起的生物学特性吻合;二者与雌孕激素的相关性也提示其可能影响子宫内膜异位症的发生发展。因此T-bet/GATA3在内异症的发生发展中可能扮演重要角色，尤其是GATA-3，而这种作用仅仅体现于对细胞因子的影响还是对子宫内膜本身的影响有待进一步验证。　　 本实验通过细胞培养，重组DNA技术、RNA干扰等一系列实验技术深入研究T-bet/GATA3在内异症发生发展中的作用及功能，从而为内异症发病机制提供新的理论依据。　　 方法：　　 一、检测GATA3对内异症在位内膜增殖的影响　　 1、原代共培养内异症在位子宫内膜和正常子宫内膜间质细胞和上皮细胞。　　 2、子宫内膜原代细胞GATA3基因RNA干扰。　　 3、子宫内膜原代细胞GATA3基因DNA重组。　　 4、利用实时荧光定量PCR和蛋白免疫印迹技术检测方法检测GATA3基因干扰后mRNA和蛋白在子宫内膜细胞中的表达。　　 5、将实验组细胞分为无干预组， RNAi干扰组，阴性对照(NC)组，空白对照(pGC)组。　　 6、将对照组细胞分为无干预组， G3干扰组，阴性对照(NC)组，空白对照(pGC)组。　　 7、CCK8法检测各组细胞增殖的变化。　　 二、雌激素对GATA3在内异症在位内膜中表达及GATA3对细胞因子分泌的影响　　 1、原代共培养内异症在位子宫内膜间质细胞和上皮细胞。　　 2、免疫细胞化学染色鉴定细胞。　　 3、除去内源性雌激素干预后，将细胞用10-8mol/l雌激素干预2h，4h，6h，8h，10h和12h　　 4、利用实时荧光定量PCR和蛋白免疫印迹技术检测方法检测GATA3基因不同时间干预后mRNA和蛋白在子宫内膜细胞中的表达。　　 5、除去内源性雌激素干预后，将细胞用10-8mol/l，10-10mol/l，10-12mol/l，三种不同浓度干预6h。　　 6、利用实时荧光定量PCR和蛋白免疫印迹技术检测方法检测GATA3基因不同浓度干预后mRNA和蛋白在子宫内膜细胞中的表达。　　 7、选择雌激素干预最佳浓度及时间，免疫细胞化学检测GATA3蛋白表达位置的变化。　　 8、子宫内膜原代细胞GATA3基因RNA干扰。　　 9、利用实时荧光定量PCR和蛋白免疫印迹技术检测方法检测GATA3基因干扰后mRNA和蛋白在子宫内膜细胞中的表达。　　 10、将细胞分为无干预组(N)，单纯雌激素干预(E2)组，RNAi干扰组，雌激素及RNAi共同干预组（E2+RNAi），阴性对照(NC)组，雌激素及阴性对照共同干预组(E2+NC)。　　 11、上述各组干预后72h收集细胞上清液。　　 12、Elisa法检测IL-2 IL-4 IL-6 IL-8 IL-10和INF的表达。　　 三、内异症患者在位内膜中T-bet/GATA3表达水平的检测　　 1、利用实时荧光定量PCR方法检测T-bet/GATA3mRNA在子宫内膜异位症在位内膜及正常子宫内膜中的表达。　　 2、利用蛋白免疫印迹技术检测T-bet/GATA3蛋白在子宫内膜异位症在位内膜及正常子宫内膜中的表达。　　 3、利用免疫组化技术检测T-bet/GATA3蛋白在子宫内膜异位症在位内膜及正常子宫内膜中的表达。　　 结果：　　 一、GATA3对内异症在位内膜细胞增殖的影响　　 将实验组及对照组细胞分为无干预组，RNAi干扰组，DNA重组(G3)组，阴性对照(NC)组，空白对照(pGC)组。实验组细胞增殖高于对照组，实验组组间相互比较，与无干预组相比，RNAi干扰组表达降低，有统计学意义(P＜0.05)，DNA重组(G3)组，表达增高，有统计学意义(P＜0.05)，阴性对照(NC)组和空白对照(pGC)组无明显变化;对照组结果与实验组一致。　　 二、测雌激素对GATA3在在位内膜中表达及GATA3对细胞因子分泌的影响　　 1、E2对GATA3刺激的时间依赖性和剂量依赖性　　 E2以不同的时间和不同的浓度作用于经无酚红培养后的细胞。共培养子宫内膜细胞中GATA3 mRNA的水平随着刺激时间的延长显著的上调了。随着处理剂量的增加GATA3 mRNA的水平也显著上调。蛋白免疫印迹的结果表明GATA3蛋白的表达水平对E2的刺激呈现了时间依赖性和剂量依赖性的上调变化。　　 2、E2对GATA3细胞表达定位的影响　　 组织实验结果表明GATA3主要表达与子宫内膜上皮细胞细胞质中，本实验对新培养的子宫内膜细胞，无酚红培养液处理后的子宫内膜细胞，10-8mol/l雌激素干预6h后的子宫内膜细胞进行免疫细胞化学，GATA3不仅仅表达量上调，同时也由细胞质表达变为细胞质及细胞核共同表达。　　 3、转染效率及SiRNA对GATA3敲除效果的检测　　 通过明暗视野拍照及流失细胞仪检测，子宫内膜细胞的病毒转染效率达80％以上，显示GATA3经SiRNA干预组与SiRNA和雌激素共同干预组的mRNA及蛋白相对表达量与未干预组比较降低(P＜0.05)，而阴性对照组及空白组均无明显变化(P＞0.05)。　　 4、GATA3对IL-2 IL-4 IL-6 IL-8 IL-10和INF的表达的影响　　 Elisa实验结果显示，与无干预组相比，雌激素干预组IL2及IL10表达增高，并且有统计学意义(P＜0.05)，IL6及IL8表达降低，有统计学意义(P＜0.05)，IL4及INF无明显变化;RNAi干预组IL6、IL8、IL10表达降低，有统计学意义(P＜0.05)，IL2及INF表达增高，有统计学意义(P＜0.05)，IL4无明显变化;雌激素及RNAi共同干预组IL6及IL8表达降低，有统计学意义(P＜0.05)，IL2及INF表达升高，有统计学意义(P＜0.05)，IL10表达略增高，无统计学意义(P＞0.05)，IL4无明显变化。　　 三、内异症患者在位内膜中T-bet/GATA3表达水平的检测　　 1、T-bet和GATA-3 mRNA表达　　 将GAPDH作为内参，分析T-bet and GATA-3 mRNA的相对表达水平，与对照组相比内异症组T-bet mRNA表达下降(P＞0.05)GATA-3 mRNA表达上升(P＜0.05)。GATA-3表达的变化明显强于T-bet，通过比较T-bet/GATA-3比值，发现T-bet/GATA-3 mRNA比值内异症组显著低于对照组（P＜0.05）.　　 2、免疫组化分析　　 免疫组化用来检测T-bet和GATA-3的蛋白表达及表达部位，实验组和对照组均可检测出T-bet和GATA-3蛋白，并且主要表达于上皮细胞的细胞质中。免疫组化评分具体见表1。与对照组相比内异症组在位内膜GATA-3(P＜0.05)表达增加，T-bet(P＞0.05)表达降低。　　 3、T-bet和GATA-3蛋白表达　　 Western blot用来定量分析T-bet与GATA-3的蛋白表达。由于内异症组T-bet表达下调，GATA-3表达上调，导致T-bet/GATA-3比值在内异症组显著低于对照组(P＜0.05)(Fig.3B)，这与qPCR结果相一致。　　 结论：　　 1、GATA-3促进子宫内膜细胞的增殖，对内异症的发生及发展起到一定作用。　　 2、GATA-3对雌激素具有浓度及时间依赖性，并且在雌激素作用下发生核内转移，同时GATA-3促进Th2类细胞因子的表达，抑制Th1类细胞因子的表达，与雌激素协同作用导致了内异症患者局部多种细胞因子的改变。　　 3、通过对T-bet和GATA-3在子宫内膜异位症患者在位内膜中的表达及细胞定位的研究，提示二者作为细胞因子调控基因起作用。T-bet的低表达和GATA-3的高表达导致了Th2免疫状态的漂移。内异症患者的在位内膜GATA-3的高表达可以作为评价Th1和Th2免疫反应的指标。