椎间盘退变是导致脊柱退行性病变的重要病理学基础,其相关并发症可引起椎间盘突出,椎管狭窄,椎体滑脱、脊柱不稳、脊柱侧弯等脊柱疾患,影响我国国民健康和生活质量。在正常人体椎间盘中,存在多个重要的生理稳态,主要包括免疫稳态、细胞稳态、细胞外基质稳态、营养稳态及氧稳态等。它们之间相互联系,密切相关。同时,它们也在不同的年龄阶段保持动态的生理平衡。这些稳态的维持是保证椎间盘正常生理功能的重要条件和基础。当稳态因不同的内因或外因被打破时,椎间盘退变的进程便悄然开始;与此同时,椎间盘的病理发展也会加快各稳态失衡。目前对于椎间盘退变机制的研究,究其根本多是围绕其稳态失衡这一核心展开;而对于椎间盘退变的治疗和椎间盘再生,通过生物材料、干细胞及刺激因子等各种途径进行稳态重构和维持是恢复椎间盘正常功能的重要前提基础。本研究旨在针对椎间盘中存在的多个重要生理稳态,分别从不同角度对椎间盘的免疫稳态、细胞稳态、细胞外基质稳态及氧稳态进行椎间盘退变机制的研究分析,并通过应用生物材料和脂肪干细胞进行稳态的干预和重构,围绕稳态这一核心,对椎间盘退变和再生机制进行深入研究。整个研究分为以下四个部分(其中第四部分包括三个实验)。第一部分椎间盘免疫稳态中Fas L对维持无血管化的作用研究实验背景及目的:椎间盘是人体最大的无血管器官,血管浸润带来的免疫细胞和炎性介质可引起椎间盘内部免疫稳态失衡。Fas L为II型跨膜蛋白,当Fas L与其配体Fas结合后,可激活表达有Fas细胞的下游凋亡通路,导致细胞凋亡。资料显示Fas L在正常椎间盘髓核细胞中具有阳性表达,同时血管内皮细胞有Fas阳性表达。因此,该部分旨在观察髓核细胞Fas L对于血管内皮细胞的作用影响,研究Fas L对椎间盘维持无血管化的分子机制,探讨其对椎间盘免疫稳态维持的作用影响。方法:分别获得人椎间盘髓核细胞和血管内皮细胞系(HMEC-1细胞),构建慢病毒上调人髓核细胞Fas L表达,ELISA检测髓核细胞培养液中可溶性Fas L(s Fas L)的表达水平。建立髓核细胞与HMEC-1细胞的非接触共培养模型,在共培养48h后消化收集细胞,对共培养后HMEC-1细胞进行流式凋亡检测,同时检测其Fas及相关凋亡通路的表达。结果:在髓核细胞的培养液中存在s Fas L表达,其浓度随椎间盘退变表达降低。通过慢病毒转染上调Fas L的髓核细培养液中的s Fas L表达水平高于无病毒转染组。HMEC-1细胞的凋亡率在正常髓核细胞共培养组明显高于退变髓核细胞共培养组。在上调髓核细胞Fas L表达后,髓核细胞可诱导HMEC-1细胞凋亡率增高。同时,HMEC-1细胞与髓核细胞共培养后,细胞中的Fas表达、相关凋亡通路FADD和Caspase-3表达也升高。结论:椎间盘髓核细胞表达的Fas L可诱导血管内盘细胞凋亡,在抑制血管浸润、阻断免疫细胞进入椎间盘发挥潜在功能。这些结果提示Fas L在维持椎间盘的免疫稳态中的重要作用。第二部分椎间盘细胞稳态中CK8在髓核细胞中的表型与降解机制研究实验背景及目的:角蛋白8(Cytokeratin 8,CK8)是角蛋白家族的重要一员,在细胞维持正常结构和形状、对生物力自体保护、蛋白分泌及细胞凋亡等多方面发挥重要作用。然而,目前研究对于CK8在髓核细胞中的表型及在退变髓核中的降解机制仍不明确,鉴于CK8表达及磷酸化与生物力学紧密相关,我们设想其在髓核细胞中的表达也受到压力影响。因此,本实验通过将髓核细胞置于高压培养环境,观察压力对其磷酸化和降解的调节机制。方法:首先,获得人椎间盘髓核组织,应用Western blot和免疫荧光检测CK8与磷酸化CK8在髓核中的表达。然后,获得并培养髓核细胞,将其分别置于3.0Mpa下培养4h,24h和48h,或于0.3Mpa,1.0Mpa及3.0Mpa下培养48h。应用Western blot和免疫共沉淀反应检测压力培养后髓核细胞CK8的磷酸化表达及其可溶性表达水平与压力培养时间和强度的相关性。同时,通过应用蛋白激酶C(PKC)激活剂和抑制剂进行髓核细胞PKC活性与CK8磷酸化关系的检测。结果:CK8在正常髓核细胞中的表达高于退变髓核细胞;而磷酸化CK8在退变髓核细胞中表达高于正常髓核细胞。髓核细胞CK8的磷酸化水平与可溶性形式随培养压力强度增加和时间延长表达明显升高。PKC-ε活性随压力强度和时间延长升高。在加入PKC激活剂PMA后,髓核细胞中的CK8表达降低,而磷酸化表达升高;加入PKC抑制剂Bis后,高压培养并未使髓核细胞中的p CK8表达升高。结论:过度压力可通过诱导CK8降解,破坏髓核细胞骨架结构,对髓核细胞稳态产生不利影响。而PCK激活和其诱导的CK8磷酸化分解是这一现象的重要机制。该部分结果揭示了生物压力在椎间盘细胞稳态中对髓核细胞骨架蛋白表达调控的分子作用机制。第三部分全氟三丁胺(PFTBA)在椎间盘氧稳态重构中的作用研究实验背景及目的:研究发现,椎间盘内部并不为完全缺氧组织,氧稳态失衡是引发椎间盘退变的重要原因。因此,特定氧稳态在椎间盘维持正常生理功能中发挥重要作用。目前,在椎间盘再生的相关生物材料学研究中,对于如何维持生物支架内营养物质稳态,特别是氧的稳态仍不明确。PFTBA是应用于组织工程学中常见的供氧载体,其具有安全、无毒、稳定释放氧气等特点。因此,该部分旨在应用PFTBA为氧稳态重构的氧浓度调节因子,阐明其在椎间盘再生中对髓核细胞命运及功能的影响。方法:制备藻酸盐凝胶与PFTBA复合物,分别调整其PFTBA浓度为2.5%,5%和10%。首先,进行物理性质的检测,包括肿胀,分解和氧气释放系数。同时,应用扫描电镜观察不同浓度PFTBA藻酸盐凝胶的微观结构。之后,在PFTBA藻酸盐凝胶中复合人椎间盘髓核细胞,分别进行平面(2D)和三维(3D)培养。在培养的细胞中应用live/dead染色,CCK-8检测和细胞计数等检测分析细胞在不同浓度PFTBA藻酸盐中在无氧和常氧环境中的生存率和增殖情况。应用rt-PCR,免疫细胞化学检测和ELISA检测分析细胞外基质和髓核标记物的表达。在体内实验中,建立动物椎间盘退变模型,将含有不同浓度的PFTBA藻酸盐复合物注入动物退变椎间盘,在一定时间后分析动物椎间盘的影像学和组织学资料,研究和评估其椎间盘状态。结果:PFTBA在本实验范围内的浓度对藻酸盐凝胶的物理特性并无显著影响。藻酸盐凝胶的氧气释放浓度与PFTBA浓度呈正相关。在体外细胞实验中,PFTBA在无氧环境中对髓核细胞的生存和增殖具有不同程度的促进作用。同时,含有2.5%PFTBA的藻酸盐凝胶可在无氧培养中促进髓核细胞合成类似于髓核组织的细胞外基质成分,且对髓核细胞标记物表达无明显作用影响。在体内研究中,我们发现2.5%PFTBA可保护动物椎间盘高度系数DHI和相关细胞外基质的表达,维持椎间盘的正常生理结构,对椎间盘退变具有治疗作用。结论:该部分研究在国内外首次应用PFTBA为氧浓度调控因子,进行椎间盘氧稳态的调节和维持。应用体外和体内实验,我们发现PFTBA可通过重构椎间盘氧稳态促进髓核再生,对椎间盘再生的组织工程学研究具有重要意义。第四部分脂肪干细胞在椎间盘稳态重构中的作用研究目前,干细胞在椎间盘稳态重构和组织工程学中受到了广泛关注和研究。其中,脂肪干细胞由于其取材易、来源广等优点,在椎间盘稳态重构和维持中发挥重要作用。本部分为三个实验,旨在通过脂肪干细胞与髓核细胞的共培养,重点分析脂肪干细胞对椎间盘的细胞稳态、细胞外基质稳态重构的重要调节作用,同时观察脂肪干细胞在椎间盘非生理压力环境中的保护作用,从多角度研究脂肪干细胞对椎间盘各稳态的重构作用机制。实验一接触性共培养对脂肪干细胞在椎间盘细胞稳态重构的作用研究实验背景及目的:目前国内外实验对于人脂肪干细胞和椎间盘髓核细胞接触性共培养方面的研究相对较少。因此,本实验旨在通过对脂肪干细胞与髓核细胞的接触性共培养,初步研究脂肪干细胞在椎间盘细胞稳态重构中的作用。方法:分别培养并获得人脂肪干细胞和椎间盘髓核细胞。对获得的脂肪干细胞进行表面标记物流式细胞鉴定。通过CFDA荧光标记脂肪干细胞,之后建立脂肪干细胞和髓核细胞的接触性共培养体系。7天后流式分离荧光标记的脂肪干细胞和无荧光的髓核细胞,通过rt-PCR分析两种细胞的分子变化。结果:人脂肪干细胞和髓核细胞生长良好。流式鉴定显示脂肪干细胞标记物CD29,CD90等表达在90%以上。共培养后流式分离两组细胞的细胞纯度均高于99%。Rt-PCR显示共培养后脂肪干细胞的SOX9,COL2A1,ACAN和COL6A2表达明显升高,其髓核细胞标记物FOXF1,PAX1,CA12,和HBB也明显升高。同时,其相关生长因子如CDMP-1,TGF-β1,IGF-1,和CTGF表达升高。此外,共培养后的髓核细胞SOX9,COL2A1和ACAN明显升高,提示髓核细胞功能有所恢复。结论:人脂肪干细胞在与髓核细胞接触性共培养后可以向髓核细胞定向分化,同时也对髓核细胞具有营养和功能恢复的作用。这表明,脂肪干细胞可通过与髓核细胞的接触性共培养,对椎间盘细胞稳态的重构发挥潜在作用。实验二脂肪干细胞与髓核细胞共培养后microRNA芯片分析实验背景及目的:在实验一中,我们通过脂肪干细胞在与髓核细胞接触性共培养,研究发现了脂肪干细胞在m RNA方面的变化。近年来研究发现,非编码RNA在椎间盘细胞生长、凋亡及相关蛋白合成等发挥重要作用。然而,国内外目前关于干细胞在向髓核细胞分化过程中其micro RNAs(mi RNA)的变化仍不明确。因此,本实验应用试验一获得的脂肪干细胞进行mi RNAs基因芯片分析,旨在初步探索和研究脂肪干细胞向髓核细胞表型分化时的mi RNAs变化。方法:使用实验3中获得及处理的6组脂肪干细胞,即与髓核细胞共培养的脂肪干细胞3组及无髓核细胞共培养的脂肪干细胞对照3组。常规获得RNA后,于mi RCURYTM LNAArray(v.18.0)芯片上进行杂交。结果:进行分析的mi RNAs中有30个明显差异表达,包括11个上调的mi RNAs及19个下调的mi RNAs。标准化的相关性分析结果发现共培养组和对照组间的mi RNA表达的差异性明显。对芯片结果进行进一步分析我们得到micro RNAs的两相等级簇状热图,从总体上说明了各个样本的mi RNAs差异表达。结论:本实验初步筛查和探索研究了脂肪干细胞在被诱导分化表达髓核细胞表型后的上下调micro RNAs具体种类和变化规律,为将来进一步研究干细胞在椎间盘稳态重构中的micro RNAs变化提供了新思路。实验三脂肪干细胞在椎间盘髓核细胞压力环境中对稳态保护作用的研究实验背景及目的:在本部分的实验一、二中,我们研究了髓核细胞通过共培养对脂肪干细胞的作用影响。但是,目前关于脂肪干细胞对于髓核细胞的影响研究却相对较少。同时,非生理压力培养会导致髓核细胞的凋亡与退变。在IDD患者中,多数已经存在脊柱的受力异常,在干细胞注射治疗中,干细胞对残存的退变髓核细胞的影响尚不明确。因此,本实验旨在研究脂肪干细胞在高压培养下对髓核细胞的凋亡与功能的作用影响。方法:获取并培养人椎间盘髓核细胞,分为实验组和对照组。实验组与人脂肪干细胞非接触共培养,置于3.0MPa的高压环境中。对照组无脂肪干细胞共培养,其他条件与实验组相同。48小时后通过流式细胞仪、细胞活死染色和扫描电镜检测两组髓核细胞的凋亡,同时检测髓核细胞的凋亡通路Caspases-3,-8和-9。另外,通过rt-PCR和免疫荧光染色检测两组髓核细胞的细胞外基质,基质金属蛋白酶,金属蛋白酶组织抑制因子,解聚蛋白样金属蛋白酶,炎性因子和细胞标记物表达。结果:脂肪干细胞可通过阻断Caspase-9和Caspase-3通路抑制髓核细胞在高压培养下的凋亡。同时,脂肪干细胞可保护髓核细胞的细胞外基质(SOX9,COL2A1 and ACAN),金属蛋白酶组织抑制因子(TIMP-1 and TIMP-2)基因表达和角蛋白8(CK8)蛋白表达。另外,脂肪干细胞可抑制基质金属蛋白酶(MMP-3,-13),解聚蛋白样金属蛋白酶(ADAMTS-1,-5)和炎性因子(IL-1β,IL-6,TGF-β1,TNF-α)表达。结论:在非生理压力培养下,脂肪干细胞可抑制髓核细胞凋亡,维持髓核细胞细胞外基质表达,调节相关蛋白酶活性、抑制炎性因子等途径保护椎间盘内稳态平衡。