大豆是我国主要的经济作物,近年来高温天气频现,部分大豆三系杂种F1的育性遭受高温胁迫后严重下降。高温引起的雄性不育主要表现为花药不散粉和小孢子败育。在此之前人们对高温引起雄性不育的分子机制研究甚少,本研究通过small RNA测序手段对大豆三系杂种NF1（NJCMS1A×N4608,耐高温杂种F1）和YF1（NJCMS1A×YY6,高温敏感杂种F1）高温胁迫处理前后的混合花芽进行测序分析,挖掘了 1326个响应高温胁迫的差异miRNAs,并对差异miRNA gma-miR156b和gma-miR397a进行更深入的功能研究,进一步为高温引起YF1雄性不育的调控机制提供研究方向。本研究获得的结果如下:1.利用small RNA测序手段对NF1和YF1高温胁迫处理前后的混合花芽进行测序分析,结果表明small RNA的片段长度主要集中在21nt和24nt上,miRNA差异表达分析得到1326个响应高温胁迫的差异miRNAs,进一步选择8个差异miRNAs进行qRT-PCR验证,发现qRT-PCR结果与small RNA测序结果基本一致。靶基因预测发现一个miRNA可以靶向多个靶基因;多个miRNAs靶向一个靶基因。small RNA测序和转录组联合分析结果表明,高温胁迫下,部分miRNAs与其靶基因存在负向调控关系。结合测序结果和靶基因预测结果,筛选了两个响应高温胁迫下调表达的差异miRNAs:gma-miR156b和gma-miR397a,为后续研究miRNA响应高温胁迫引起雄性不育的分子机制提供数据支撑。2.在本实验室对gma-miR156b过表达转基因拟南芥研究的基础上,对其功能研究发现,gma-miR156b过表达转基因拟南芥开放花的长度变小,花药变小且花粉数目减少,结实率降低但种子增大,百粒重升高。进一步研究发现,gma-miR156b通过抑制其靶基因SPL的下游基因LBD和AGL的表达来参与植物的生长发育。Small RNA和转录组联合分析及qRT-PCR分析结果显示,gma-miR156b及其靶基因GmSPL2b响应高温胁迫并存在负向调控关系。为了验证gma-miR156b响应高温胁迫参与植物的雄性生殖发育,本研究对gma-miR156b过表达转基因拟南芥和大豆在花期进行高温胁迫处理实验。研究发现,在高温胁迫下,gma-miR156b过表达转基因拟南芥和大豆均出现了花药不开裂和花粉败育现象,而对照组的花药开裂正常。其中gma-miR156b过表达转基因大豆在高温胁迫处理第3天出现了花粉完全败育现象,而对照组在第7天出现了花粉完全败育现象。进一步测量和观察发现,高温胁迫后gma-miR156b过表达转基因大豆叶片失水率、DAB和NBT活性氧染色程度下降。以上结果表明gma-miR156b可能在响应高温胁迫和调控大豆雄性不育中具有重要作用。3.Small RNA测序分析显示,高温胁迫虽然抑制了gma-miR397a的表达,但它在YF1中的表达水平比在NF1中的高。gma-miR397a过表达转基因大豆的功能研究发现,gma-miR397a过表达转基因大豆植株弱小、株高降低。对其进行高温胁迫处理,结果显示处理前gma-miR397a过表达转基因大豆和对照组的花药开裂正常,处理的第5天gma-miR397a过表达转基因大豆的花药不开裂而对照组大豆花药开裂正常,第7天对照组大豆花药也出现不开裂。进一步测量和观察发现,高温胁迫后gma-miR397a过表达转基因大豆叶片失水率、DAB和NBT活性氧染色程度下降。以上结果表明gma-miR397a可能在响应高温胁迫和调控大豆雄性不育中具有重要作用。