黄河鲤和两种泥鳅中AMH基因的克隆及其表达分析

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抗苗勒管激素(AMH),也称为苗勒管抑制物质(MIS),属于β转化生长因子(TGF-β)超家族的成员之一,具有调节生殖细胞发育及分化的作用。在哺乳动物中,大量的研究表明,AMH基因除了在雄性性别分化过程中诱导苗勒管的退化,在雄性和雌性的性腺类固醇的生成和分化过程中还产生了抑制作用。在低等脊椎动物硬骨鱼中,AMH的功能研究的还很少。研究的第一步就是揭示AMH基因在硬骨鱼生殖过程中的潜在作用,从黄河鲤和两种泥鳅中分离并描述出AMH基因的特征,然后分析其基因的转录物表达。根据已报道的资料在AMH的中间保守区设计一对兼并引物,通过PCR方法分别对黄河鲤和两种泥鳅进行cDNA水平上的扩增,在黄河鲤和两种泥鳅AMH基因的中间保守区均能扩增得到一条455bp的片段,经过测序其就是黄河鲤和两种泥鳅AMH基因的中间序列。在此基础上通过3′RACE和PCR相结合的方法,可以得出黄河鲤的cDNA全长序列,两种泥鳅cDNA的中间和3′端序列。结果表明:黄河鲤AMH基因cDNA序列全长约2000bp,含有一个1676bp的开放阅读框(ORF),共编码538个氨基酸,3′非翻译区长340bp(包含polyA);泥鳅AMH基因cDNA克隆片段大小为1331bp,编码328个氨基酸,3′非翻译区长345bp(包含polyA);大鳞副泥鳅AMH基因cDNA克隆片段大小为1327bp,编码328个氨基酸,3′非翻译区长341bp(包含polyA)。对黄河鲤和两种泥鳅的氨基酸序列进行分析,发现其羧基端(C端)的保守区有8个半胱氨酸残基,这是TGF-β超家族特征之一。通过系统进化分析和蛋白质同源性比对,在黄河鲤中,黄河鲤和鲤科拟白鱼属的S. pyrenaicus的之间AMH基因的同源性最高,达到81.4%,同鲤科拟白鱼属的S. alburnoides和斑马鱼的相似性分别达到76.1%、68.6%。在两种泥鳅中,泥鳅和大鳞副泥鳅之间AMH基因的部分序列的相似性最高,达到88.7%,它们同鲤鱼、斑马鱼之间的相似性也很高,这些数据都表明黄河鲤和两种泥鳅的AMH基因在进化上与鲤形目的亲缘关系较近。两种泥鳅的组织和胚胎RT-PCR分析的结果表明:MaAMH基因在各个组织中都有不同程度的表达,其中以卵巢中表达量最高。MaAMH基因在胚胎的各个时期都有表达,其中以卵黄吸收期的表达量最高,其它各个时期的表达量都较弱。PdAMH基因在各个组织中都有表达,其中以心脏中的表达量最高。
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