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本文旨在通过克隆存在于金钗石斛中的MADS-box基因,并通过半定量RT-PCR对其时空表达模式和低温处理以及激素处理对其表达的影响进行初步探讨,为以后的功能研究和实际应用提供依据。主要研究结果如下:
(1)MADS-box基因的克隆。以金钗石斛的类原球茎为材料,参照各种兰花中已经克隆得到的MADS-box 基因的序列设计特异性引物,克隆得到两种MADS-box基因:DNMADS1(gb | EF535598)和 DNMADS2(gb | EF535599),分别属于AP1/FUL 和AG/STK类MADS-box基因的同源基因。序列比对分析表明,DNMADS1与密花石斛(Dendrobium thyrsflorum)中的DthyrFL1基因具有98%的相似性,而对应蛋白序列与拟南芥中AP1蛋白具有68%的同源性;DNMADS2与DthyrAG2具有96%的相似性,对应蛋白序列与拟南芥中AG蛋白具有65%的同源性。
(2)基因表达的时空特异性。以金钗石斛ACTIN基因为对照,进行半定量RT-PCR 分析,结果表明DNMADS1在金钗石斛的类原球茎和试管苗的根、茎、叶等营养器官均有表达,在成熟花器官中的侧萼也有一定量的表达,在合蕊柱中有微量的表达。DNMADS1在花芽发育的早期并没有表达,经过10d左右的发育后出现一定量的表达。但随后其表达又受到抑制,到花芽发育的晚期才又有表达。DNMADS2只在类原球茎中有表达,在试管苗的根、茎、叶等器官中都不表达,在成熟花器官的合蕊柱中有一定量的表达,而在各发育阶段的花芽中都未见表达。
(3)低温和激素处理对DNMADS1和DNMADS2表达的影响。低温对DNMADS1表达的影响不明显,但是却对DNMADS2产生一定的影响。低温抑制类原球茎中DNMADS2的表达,却促进它在叶片中的表达,在根中的表达出现在一定的处理时期。
采用细胞分裂素处理金钗石斛类原球茎,DNMADS1和DNMADS2的表达受到一定的影响,6-BA 可以在一定程度上促进二者的表达,而TDZ则可以抑制二者尤其是DNMADS2在类原球茎中的表达。但在花芽的发育中,TDZ则有可能起一定的促进作用。植株喷施20mg/L 的。TDZ后,花芽中仍然没有检测到DNMADS2的表达,但是DNMADS1的周期性表达却提前。