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研究背景与目的：足细胞是构成肾小球滤过屏障最重要的细胞成分,具有复杂而精细的细胞结构,主要由细胞胞体、主突及足突三部分组成,相邻足突间形成特异性分子筛结构即裂隙膜(slit diaphragm, SD)。足细胞损伤、SD结构破坏是引起蛋白尿及肾小球硬化的重要发病机制。Nephrin是特异表达于足细胞的重要结构蛋白和信号分子,属于免疫球蛋白超家族成员,主要由胞外段、胞内段及跨膜段三部分组成。Nephrin胞外段通过嗜同性或嗜异性结合能力与相邻Nephrin分子或与Nephrin同源的nephl分子相互交联形成SD结构；Nephrin胞内段含有3个进化保守的酪氨酸残基,具有重要的信号转导功能。在对多种足细胞损伤模型的研究中发现Nephrin表达、分布及磷酸化水平发生改变。肾素-血管紧张素-醛固酮系统(RAAS)异常活化是导致肾损伤的重要机制,其中血管紧张素Ⅱ(AngⅡ)是主要的效应分子。研究发现AngⅡ呈剂量和时间依赖的方式诱导足细胞凋亡、F-actin重组,并影响Nephrin表达、分布及其磷酸化水平,但其具体机制尚不清楚。Caveolae是一种特殊的脂筏结构,具有胞吞、胆固醇转运、稳定胞膜及信号转导等多种功能。Caveolin-1是构成caveolae的关键分子,在信号转导或不同信号通路“串话”中发挥重要作用。研究发现,Nephrin、podocin、CD2AP等足细胞特异性分子定位于caveolae结构,Caveolin-1可能在AngⅡ诱导的Nephrin磷酸化改变中起重要作用。本研究通过AngⅡ输注大鼠模型及体外足细胞培养,观察AngⅡ刺激对Nephrin和Caveolin-1表达及磷酸化水平的影响,评价AngⅡ对肾小球足细胞损伤的影响；通过转染足细胞Caveolin-1全长质粒或其siRNA,上调或下调Caveolin-1表达,观察其对AngⅡ诱导的足细胞损伤及Nephrin磷酸化改变的影响,并进一步探讨其可能的分子机制。方法：第一部分：36只Wistar大鼠皮下埋置渗透性微泵,随机分为AngⅡ输注组,Ang Ⅱ+替米沙坦干预组及正常对照组,其中AngⅡ输注剂量为400ng·kg-1·min-1,替米沙坦干预剂量为3mg·kg-1·d-1,持续28天。分别于造模前及造模后7d、14d、21d、28d测量大鼠尾动脉压并收集24小时尿液,测定尿白蛋白含量；分别于造模14d和28d处死动物,收集血标本和肾组织标本,检测血肌酐(Scr)并计算肌酐清除率(Ccr)；放射免疫法检测血浆及肾组织Ang II浓度；PAS染色观察肾小球病理改变,透射电镜观察足细胞超微结构改变,免疫组化或免疫荧光染色观察Caveolin-1/Nephrin在肾小球表达、分布及磷酸化改变,Western-blot检钡Nephrin蛋白表达及其磷酸化水平改变。第二部分：体外培养永生化小鼠足细胞,随机分为正常对照组、AngⅡ刺激不同时间(3h、6h、12h及24h)组、氯沙坦干预组(10-6mol/L Ang Ⅱ+10-5mol/L Losartan作用6h),收集各组细胞,免疫荧光染色及Western-blot检测Caveolin-1/Nephrin表达及磷酸化改变,蔗糖密度梯度超速离心分离足细胞脂筏结构,Western-blot检测Caveolin-1、Nephrin、AngⅡ1型受体(AT1R)及Src激酶负性调节因子Csk在胞膜不同区域分布情况,免疫共沉淀检测Caveolin-1、Nephrin、AT1R及Csk之间相互作用。第三部分：构建Caveolin-1全长质粒(pEGFPC3-cav-1),脂质体转染法体外转染足细胞,G418筛选建立稳定转染足细胞系,上调Caveolin-1表达；设计合成Caveolin-1特异性小干扰RNA (cav-1siRNA)并体外转染足细胞,下调Caveolin-1表达；细胞分组：正常对照组、Ang Ⅱ刺激组,Ang Ⅱ+pEGFPC3-cav-1转染组,Ang Ⅱ+空载体pEGFPC3转染组、AngⅡ+cav-1siRNA转染组,AngⅡ+scrambled siRNA转染组。Western-blot检测各组足细胞Caveolin-1/Nephrin,总蛋白表达及其磷酸化水平改变；Hoechst-33342染色评价各组足细胞凋亡；FITC-phalloidin染色标记足细胞F-actin,采用外周F-actin环评分系统(CFS)分析足细胞F-actin重组。结果：第一部分：Ang Ⅱ输注组大鼠血压和尿白蛋白量在相同时间点明显高于正常对照组和替米沙坦干预组(p<0.05),但各组间Ccr差异无统计学意义(p>0.05); Ang Ⅱ输注组大鼠肾小球系膜区增宽、基质增多,部分肾小球出现局灶节段硬化,足细胞足突出现广泛融合甚至消失,替米沙坦干预组肾小球及足细胞病理改变明显轻于Ang Ⅱ输注组；Ang Ⅱ输注组大鼠肾小球Nephrin表达及磷酸化水平明显降低(p<0.05),Caveolin-1磷酸化水平明显增高(p<0.05),但各组间Caveolin-1总蛋白表达差异无统计学意义(p>0.05)。第二部分：足细胞在正常状态下Caveolin-1蛋白表达丰富,并呈低水平磷酸化状态；Ang Ⅱ刺激引起Nephrin表达及磷酸化水平明显下降(p<0.05),Caveolin-1磷酸化水平明显增加(p<0.05), Caveolin-1总蛋白表达较正常对照组及Losartan干预组差异无统计学意义(p>0.05)；脂筏分离实验显示足细胞Nephrin和Caveolin-1主要共定位于caveolae层,AT1R和Csk主要分布在非caveolae层,AngⅡ刺激3h后引起caveolae层内AT1R及Csk表达增多,并与Caveolin-1相互作用形成复合物。第三部分：pEGFPC3-cav-1稳定转染足细胞使Caveolin-1表达较基础水平增加约2倍,AngⅡ刺激后,Caveolin-1磷酸化水平明显升高,足细胞凋亡率及CFS评分明显增加,Nephrin磷酸化水平明显降低,与未转染或转染空载体组足细胞相比差异有统计学意义(p<0.05); cav-1siRNA转染足细胞48h引起Caveolin-1表达下调约60%；cav-1siRNA转染足细胞后明显抑制AngⅡ诱导的Caveolin-1磷酸化、Nephrin去磷酸化,并显著改善AngⅡ诱导的足细胞凋亡及F-actin重组,与对照组或scrambled siRNA转染组比较,差异有统计学意义(p<0.05)。结论：正常足细胞Nephrin呈一定水平磷酸化状态；AngⅡ可以诱导足细胞Nephrin去磷酸化；Nephrin磷酸化水平下调可能是AngⅡ诱导足细胞损伤的重要机制；AngⅡ通过Caveolin-1依赖的方式诱导Nephrin去磷酸化及足细胞损伤,干扰Caveolin-1表达或其磷酸化水平可以影响AngⅡ诱导的Nephrin去磷酸化改变及足细胞损伤。