霍乱弧菌(V.cholera)是一种革兰氏阴性、兼性厌氧、水生的弧菌,同时也是人类烈性传染病霍乱的病原体。目前对霍乱弧菌在实验室条件和致病条件下基因表达调控的研究较为详细,但对其在自然水体中的生存情况及相关基因的表达调控研究较少,主要是由于缺少合适的模型。霍乱弧菌在淡水中一般不能独立生活,需要附着在水生动、植物体表才能生存,因此鱼类可能是霍乱弧菌的中间宿主之一。而斑马鱼(Danio rerio)模型是研究与动物相关的微生物在活体条件下生长或致病的一种相对简单和方便的动物模型。为了建立斑马鱼模型研究自然条件下霍乱弧菌的生存和定殖情况,本文将斑马鱼放在含有约1×105CFU/mL霍乱弧菌的水中,发现霍乱弧菌在24h内就能在斑马鱼的肠道中定殖。首先,通过霍乱弧菌毒力调控相关基因的缺失突变株与野生型菌株的竞争定殖实验,发现△luxO和△aphA突变株的竞争系数与其它突变株相比差异最大,分别为0.122和7.655,说明这两个基因的缺失对霍乱弧菌在斑马鱼体内定殖能力影响最大；但是在乳鼠模型中,aphA的缺失突变株在肠道定殖的能力小于野生型菌株。同时与群体感应相关基因的缺失对霍乱弧菌在斑马鱼模型中定殖能力的影响远远小于在乳鼠模型中,因此毒力调控相关基因的缺失对霍乱弧菌在斑马鱼体内定殖能力的影响较小其次,在单独定殖实验中,△toxT突变株的定殖数量与野生型菌株相当,说明毒素共调节菌毛(TCP)并没有在斑马鱼体内表达,因此对其在斑马鱼体内定殖没有影响,这是与霍乱弧菌在乳鼠小肠中定殖时区别最大的地方,推测霍乱弧菌在斑马鱼体内定殖以生存、增殖为主要目的。综合比较基因缺失突变株和野生型菌株在单独和竞争定殖实验中的定殖情况,发现△hapR突变株(该菌株在两种情况下定殖数量没有显著性差异)在竞争定殖实验中使野生型菌株的数量比其在单独定殖时增加了11倍；而野生型菌株(该菌株在两种情况下定殖数量没有显著性差异)使△aphB突变株的数量比单独定殖时下降了54倍。说明不同基因的缺失对霍乱弧菌在中间宿主体内与其它菌株的竞争时产生不同的影响,这对揭示霍乱弧菌在自然条件下的生存机制提供了新的思路。最后,本文选取了LuxR家族、LysR家族以及胞外蛋白酶家族中一些基因缺失突变株,研究它们在斑马鱼体内定殖的能力。结果发现LuxR家族的vc1277基因缺失突变株在斑马鱼体内定殖能力比野生型菌株提高了4.548倍,且有研究表明斑马鱼肠道能产生AHLs类信号分子,该分子是LuxR蛋白的诱导物,它可与LuxR蛋白结合从而影响其下游基因的表达。在LysR家族蛋白中,△oxyR突变株在单独接种实验中的定殖数量比野生型菌株降低了约16倍,但是当二者竞争定殖时,△oxyR突变株与野生型菌株的定殖数量无显著性差异,而相同的试验在乳鼠模型下则没有任何差异,说明OxyR调控氧代谢相关基因的表达对霍乱弧菌在斑马鱼体内抵抗ROS的过程中发挥了作用。而在胞外蛋白酶基因缺失突变株中,基因vc0524、vca0849和vca0812编码的蛋白酶对于霍乱弧菌在斑马鱼体内定殖起到了抑制作用。同时,△prtV突变株在水体中比野生型菌株降低了约83倍,表明该金属蛋白酶对霍乱弧菌在自然水环境的生存中发挥了极大的作用。综上所述,本文揭示了在斑马鱼模型中影响霍乱弧菌在宿主体内定殖能力的基因与在乳鼠模型下存在较大的差异,并且这些基因与致病性没有直接关系。因此该模型对研究霍乱弧菌在中间宿主体内的生存繁殖具有重要意义,为筛选在自然条件下影响霍乱弧菌生存的重要基因提供研究平台。