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研究背景和目的胃癌(Gastric carcinoma,GC)是一种常见的消化道恶性肿瘤,具有高发病率、高死亡率的特点。在全世界范围内恶性肿瘤发病率的排名中居于第5位,而致死率则位居第3位。在我国恶性肿瘤的发病率中位居第2位,死亡率位列第3位,因此研究引起胃癌发生及转移的具体机制,进而探索新的干预措施,提高胃癌的治疗效果,达到延长患者的存活率,改善患者的生活质量的目的等方面均具有重大的意义。肿瘤介导的免疫抑制已被认为是肿瘤逃避免疫破坏的关键因素之一,与肿瘤的发生发展密切相关。T-reg细胞作为肿瘤免疫逃逸机制的一种重要媒介,CD4+CD25+Fox3+Treg细胞则是T-reg细胞中的一种特殊的亚群,具有免疫抑制和免疫无能两大特性,并在多种恶性肿瘤的组织和外周血中呈现出高表达,可能在肿瘤的特异性位点抑制肿瘤的T细胞反应。在对肿瘤的免疫抑制机制进行研究的同时,随着高通量测序技术的发展,也在针对性的研究了在肿瘤发生发展中发挥作用的蛋白编码基因功能。长链非编码RNA(long non-coding RNA,lncRNA)已被证实参与胃肠道肿瘤的形成与发展,并可能以多种方式参与基因转录和转录后调控,可作为早期消化道肿瘤的筛查标志。既往对胃癌的lncRNA的研究中,主要是对胃癌组织及癌旁组织的lncRNA进行检测,并且对胃癌发病机制的研究主要集中在肿瘤细胞的lncRNA的表达异常上,而很少涉及肿瘤免疫细胞的作用机制。本研究拟通过与健康对照组相对比,检测胃癌患者外周血中T细胞是否存在异常分布。并通过高通量芯片筛查技术探索相应T细胞中是否存在lncRNA异常表达,经筛查出具有高表达及高稳定性的linc-POU3F3作为代表,探索linc-POU3F3与T-reg细胞之间的相关作用。此外,前人研究已发现T-reg细胞通过TGF-beta信号通路发挥作用,并且有研究认为linc-POU3F3也可直接激活TGF-beta信号通路而在肿瘤的增殖中起作用,但具体机制尚不明确。因此,在本研究最后部分拟通过免疫共沉淀技术来揭示linc-POU3F3的调控作用,并探索其与T-reg细胞的相互作用机制。研究方法在本研究中,首先采集胃癌患者(n=40)及健康对照组(n=40)的外周血,通过细胞分离培养技术提取外周血中的T淋巴细胞,并采用流式细胞技术检测外周血中T-reg细胞的表达。同时,运用高通量长链非编码RNA转录基因芯片技术对胃癌患者的血浆样本进行筛选,选择表达最高也最稳定的lncRNA作为候选的研究目标,并将其与胃癌患者的相关临床信息进行结合分析。经RT-PCR对其进行检测,从而了解该lncRNA在胃癌外周血中T-reg细胞中表达。在第二部分研究中,主要针对linc-POU3F3在免疫细胞及肿瘤细胞中的功能进行研究。为了进一步探索linc-POU3F3对T细胞的作用,尤其是对T-reg细胞分布的影响。采用慢病毒包装及转染的方法将linc-POU3F3与T细胞相结合从而获得稳定的细胞株,并通过免疫荧光及RT-PCR检测linc-POU3F3的表达状态,并采用流式细胞学检测经慢病毒包装的T-reg细胞的表达水平。应用Transwell培养系统将过表达linc-POU3F3的T细胞与肿瘤细胞进行共同培养增殖,从而观察肿瘤细胞的增殖状态。最后部分,针对linc-POU3F3的调控机制进行了研究。据研究,linc-POU3F3可以直接激活TGF-beta信号通路,并且T-reg细胞的分布与TGF-beta信号通路是密切相关的。在此研究阶段,我们采用放射免疫沉淀技术及western blot方法来检测linc-POU3F3与TGF-beta之间的作用。研究结果经流式细胞学检测在胃癌患者外周血中调节性T-reg细胞的分布水平明显高于健康对照组,而且通过lncRNA微列检测表明在胃癌患者T-reg细胞的lncRNAs与对照组相比表达异常。通过对已知的肿瘤相关的lncRNA进行筛查,发现linc-POU3F3表现出最高的倍数变化以及最稳定的表达形态,因此我们将linc-POU3F3作为潜在的标志物进行研究。结合胃癌患者的有关临床资料进行分析,发现linc-POU3F3可能对患者胃癌的生长分布及临床TNM分期等方面均有一定的影响作用。在体外细胞功能的研究发现,通过慢病毒包装转染的T细胞中linc-POU3F3呈现出过表达状态,linc-POU3F3的过表达促进了细胞的增殖及侵袭能力,并伴有体外T-reg细胞的分布增加。进一步将T-reg细胞与肿瘤细胞进行共培养,结果表明linc-POU3F3上调培养的T细胞明显促进了肿瘤细胞的增殖。在对linc-POU3F3调控机制的研究则显示与TGF-beta信号通路的激活相关。通过体外实验表明,linc-POU3F3可以直接与TGF-beta相结合,引起TGF-beta的上调,并通过Smad2/3磷酸化激活TGF-beta信号通路,从而在增加胃癌细胞的增殖中发挥重要的作用,进而进一步的影响着胃癌的发生发展过程。结论linc-POU3F3过表达可导致胃癌患者外周血中T-reg细胞的分布增加,并且linc-POU3F3过表达的T-reg细胞可促进胃癌细胞增殖能力并通过招募TGF-beta从而激活TGF-beta信号通路来促进肿瘤细胞的增殖。本研究可能为胃癌免疫细胞中lncRNA的功能的探索提供了新的思路。