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九节茶(Sarcandra glabra(Thunb.)Nakai)为常用传统中药材,对肺炎、阑尾炎等炎症性疾患和多种恶性肿瘤具有显著疗效。随着以九节茶为原料的新产品的不断开发,对野生九节茶原材料需求量越来越大,无限制的采挖使野生资源遭到破坏,造成原料药材供应紧张。目前人工栽培中常用的繁殖方法是扦插、分株和播种繁殖。但九节茶结实少,种子萌发率低,扦插、分株繁殖速度慢,难以提供大量优质种苗。建立九节茶离体快速繁殖体系,可高效繁育优质种苗,对保护野生资源与生态环境,以及促进中药材GAP规范化管理与生产具有重要意义。本研究以野生九节茶茎段为外植体,通过丛生芽途径建立了九节茶离体快繁体系,对移栽后不同时间的组培苗的化学成分和药效进行初步分析,并找到一种适合九节茶外植体消毒的方法。主要实验结果如下:
1.九节茶茎段初代培养污染率极高,采用常规表面消毒方法难以获得大量无菌材料,特别是培养后期出现的细菌状污染难以控制。本实验通过采用多种表面消毒方法、改善植株栽培环境、筛选外植体的种类、大小和取材部位等都无明显效果。分离九节茶组织培养后期出现的常见污染菌,并测定其对抗生素的敏感性,发现利福平对分离的8个菌株都有较好的抑制作用,于是利用抗生素利福平和间歇消毒方法结合使用,获得较好的消毒效果。最有效的外植体消毒方法为:九节茶的幼嫩茎段经75%酒精处理30s后,用0.1%升汞溶液消毒10min,然后浸于120mg·L-1的利福平溶液中振荡2~4d,再用0.1%升汞溶液消毒10min,可以达到较佳的消毒效果,消毒成功率可达55.56%。
2.以野生九节茶茎段为外植体的离体快繁体系的建立以3种基本培养基、3种浓度的6-BA以及NAA进行正交试验Lg(33),筛选得出最佳芽诱导培养基为MS+6-BA4.0mg·L-1+NAA0.0mg·L-1,诱导率为100%。
采用6-BA、TDZ和KT三种细胞分裂素,并配合使用一定浓度的NAA,研究不同植物生长调节物质种类及浓度对九节茶丛生芽增殖的影响。三种细胞分裂素对九节茶丛生芽增殖的作用大小为:6-BA>TDZ>KT。在保证丛生芽生长正常的前提下,最高增殖倍数为4.48,所用培养基为MS+6-BA4.0mg·L-1+NAA0.2mg·L-1,最佳继代周期为35d。
研究生长素(IBA和NAA)、无机盐浓度和蔗糖浓度对不定根形成的影响发现,生根培养适宜培养基为1/2MS+IBA0.2mg·L-1+蔗糖30g·L-1或1/4MS+IBA0.2mg·L-1+蔗糖30g·L-1。根系生长良好的组培苗,在出瓶前通过适当方法的炼苗,栽入泥炭土和河沙1:1混合成的基质中,移栽成功率可达95%。
3.通过对九节茶组培苗和成年野生植株的薄层色谱和体外抑菌活性的比较,结果表明移栽时间达18个月的组培苗与成年野生植株的化学成分及体外抑菌活性具有很大的相似性。移栽18个月组培苗,薄层色谱各斑点指纹与成年野生植株一致;两者对金黄色葡萄球菌和大肠杆菌分别具有相同水平的抑制作用,最低抑菌浓度为62.5mg·ml-1和125mg·ml-1。药学分析初步表明,九节茶组培苗在离体再生过程中未发生明显变异,栽培后能保持原种的特性,可应用于生产。