目的:线粒体形态分布的动态变化深刻地影响着线粒体功能、细胞能量代谢。线粒体移动的机制研究刚刚起步,对骨骼肌细胞中线粒体移动的变化及过氧化氢(H2O2)、Ca2+对骨骼肌细胞线粒体移动调控分子机制的认识尚不清楚。本研究拟以急性运动为模型,研究骨骼肌在能量需求急剧变化过程中,线粒体移动与融合分裂蛋白表达的动态改变、H2O2浓度及线粒体功能变化特征,初步探讨线粒体移动、融合、分裂蛋白动态表达之间的可能关系及其生理意义。并试图通过离体实验进一步深入研究外源H2O2造成适度氧化应激条件下,线粒体动力学变化特征及其调控机制。从线粒体形态、分布的动力学新视角探究H2O2、Ca2+参与调控线粒体移动分布的细胞信号转导微细过程及其对线粒体融合分裂动态变化的影响。为进一步研究运动性疲劳,运动防治代谢性疾病、神经退行性疾病和衰老提供新靶向和理论依据。方法:以C57 BL/6小鼠一次中等强度负荷跑台运动(0°,13m/min)为实验模型,随机分为5组:安静对照组(R)、运动30min(E30)、60 min(E60)、90 min(E90)、120min(E120)组,分别应用Oxytherm液相氧电极测定小鼠下肢骨骼肌线粒体呼吸控制比(RCR),采用荧光素-荧光素酶发光法用发光仪测定ATP合成酶活性、可见-紫外分光光度计检测骨骼肌H2O2浓度,利用westrn blotting、荧光定量PCR方法分别观察运动中骨骼肌Miro1、Mfn2、Drp1蛋白基因表达变化和采用组织免疫荧光法观察Miro1在骨骼肌组织中的分布特征。探讨在急性运动中骨骼肌线粒体能量代谢与线粒体移动相关蛋白Miro1、融合蛋白Mfn2及分裂蛋白Drp1的动态表达变化以及之间的相互关联;利用外源H2O2处理C2C12小鼠骨骼成肌细胞株造成轻度氧化应激条件下,应用Oxytherm液相氧电极测定C2C12细胞耗氧速率,用荧光分光光度计测定细胞内ATP生成量,并检测C2C12细胞Miro1、Mfn2、Drp1 mRNA蛋白表达变化,证实是否H2O2作为信号分子调控骨骼肌细胞线粒体动力学相关蛋白及其可能的生理意义;利用激光共聚焦显微镜检测H2O2、Ca2+对C2C12细胞线粒体移动及细胞内自由钙离子浓度([Ca2+]i)动力学变化、H2O2动力学变化的影响,从而探索H2O2、Ca2+对骨骼肌成肌细胞线粒体移动的调控特征以及具体机制。结果:一、急性运动中骨骼肌线粒体移动与线粒体动力学的变化本研究首次发现:C57 BL/6小鼠一次120分钟中等强度负荷跑台运动过程中骨骼肌线粒体移动关键蛋白Miro1基因及蛋白表达较对照组显著增高。线粒体融合蛋白Mfn2 E60～E120组基因及蛋白表达较安静组显著降低;线粒体分裂蛋白Drp1 E60、E90组mRNA及蛋白表达较安静组显著增高。且急性运动过程中Mfn2基因蛋白表达显著下调,Drp1基因蛋白表达上调,Miro1基因蛋白表达的增加先于Mfn2、Drp1基因蛋白表达变化。在运动中各时间点骨骼肌H2O2均较安静组显著增高,骨骼肌线粒体ATP合成酶活性在运动30分钟组显著升高后出现下降趋势,其余各组与安静组没有显著性差异。E30、E60组骨骼肌线粒体态3呼吸速率显著高于安静组,E60组态4呼吸速率显著高于安静组,120分钟急性运动过程中线粒体RCR无显著变化。二、Ca2+调控骨骼肌成肌细胞线粒体移动C2C12骨骼肌成肌细胞线粒体呈现频繁的活动状态,主要为移动和局部摆动两种模式。外源10mmol/L CaCl2诱导线粒体移动减少同时[Ca2+]i升高,且[Ca2+]i升高同时细胞胞浆H2O2浓度([H2O2]i)降低;5mmol/L EGTA诱导线粒体移动增加同时[Ca2+]i降低,且[Ca2+]i减少时[H2O2]i升高。三、H2O2对骨骼肌成肌细胞线粒体移动、融合分裂及线粒体功能的影响1不同浓度H2O2对C2C12骨骼肌成肌细胞存活率及脂质过氧化程度影响不同:低浓度(1μmol/L~100μmol/L )H2O2对细胞存活率没有明显的影响,高浓度(1mmol/L、10mmol/L)H2O2明显降低细胞存活率。10mmol/L H2O2对C2C12细胞有显著的氧化损伤,其余较低浓度H2O2仅诱导C2C12细胞轻微氧化应激,无明显损伤作用。10μmol/L H2O2可诱导骨骼肌成肌细胞轻度氧化应激,同时诱导Miro1基因蛋白表达增高、分裂基因drp1呈现先升高再降低的趋势、融合蛋白mfn2基因蛋白表达呈现先降低后逐渐回复趋势;且Miro1基因蛋白表达变化先于mfn2、drp1改变,Ca2+参与H2O2对Miro1基因蛋白表达的调控。2不同浓度H2O2对C2C12骨骼肌成肌细胞线粒体移动具有双向调控作用,较低浓度阈值范围(1μmol/L～1mmol/L)H2O2促进线粒体移动,而高浓度(10mmol/L)H2O2对线粒体移动则呈抑制作用。3低浓度(100nmol/L~1mmol/L)H2O2对C2C12骨骼肌成肌细胞呼吸有短暂的抑制作用,随即恢复原有细胞呼吸速率,且随着H2O2浓度递增,抑制呼吸时间延长;高浓度10mmol/L H2O2对细胞呼吸具有强烈的抑制作用。1μmol/L、10μmol/L低浓度H2O2对骨骼肌成肌细胞ATP含量无明显影响,100μmol/L～10mmol/L较高浓度H2O2降低细胞ATP含量。四、H2O2调控骨骼肌成肌细胞线粒体移动机制10μmol/L H2O2促进C2C12骨骼肌成肌细胞线粒体移动,同时诱导[Ca2+]i降低。预先加入5mmol/L EGTA,再加入H2O2则诱导的线粒体移动增加及[Ca2+]i降低幅度明显低于单独H2O2对线粒体移动的调控幅度;预先加入5μmol/LThapsigargin显著升高[Ca2+]i同时线粒体移动减慢,随后加入10μmol/L H2O2仅诱发[Ca2+]i轻微降低,同时H2O2对线粒体移动的影响明显低于单独H2O2对线粒体移动的调控。结论:1小鼠一次120分钟中等强度负荷跑台运动过程中骨骼肌线粒体移动增多,线粒体融合受抑制趋于分裂,且线粒体移动蛋白Miro1基因蛋白表达上调可能作为融合分裂基因蛋白表达变化的先导促进线粒体网络结构趋于分裂以利于线粒体重新分布,可能利于促进线粒体呼吸及ATP合成以协同应对细胞能量需求的急剧变化进行早期快速应答;2骨骼肌成肌细胞线粒体呈现频繁的移动和局部摆动两种模式的活动状态。[Ca2+]i变化调控骨骼肌成肌细胞线粒体移动:[Ca2+]i升高线粒体移动减少、[Ca2+]i降低线粒体移动增加;3不同浓度H2O2对骨骼肌成肌细胞线粒体移动具有双向调控作用,较低浓度H2O2促进线粒体移动,高浓度H2O2抑制线粒体移动;H2O2诱导骨骼肌成肌细胞轻度氧化应激,并作为信号分子通过Ca2+调控线粒体移动,且移动可能作为融合分裂基础促使线粒体网络结构重新分布,首先分裂增加融合减少,随后可能由于细胞对轻微氧化应激产生适应性反应,线粒体融合分裂状态重新调整趋于融合增多分裂减少的动力学改变;4 H2O2促进骨骼肌成肌细胞线粒体移动同时诱导[Ca2+]i降低,其中肌浆网钙泵对Ca2+的摄取是H2O2诱导[Ca2+]i降低的因素之一,胞外Ca2+内流参与H2O2对线粒体移动的调控及诱导的[Ca2+]i变化。