亚洲玉米螟GSTs RNAi干扰载体构建及功能研究

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亚洲玉米螟是我国重要的粮食害虫之一,分布广且危害严重。亚洲玉米螟严重危害我国玉米产量和品质。目前对于亚洲玉米螟的化学防治和生物防治面领着亚洲玉米螟不断产生抗药性的制约。因此。探寻新的亚洲玉米螟生物防治途径已成为急需解决的问题。在本实验中,我们以亚洲玉米螟三龄幼虫对茉莉酸甲酯诱导玉米抗性的取食相应过称为研究对象。构建了此过程中的亚洲玉米螟中肠cDNA文库。并结合测序结果与欧洲玉米螟EST序列构建了玉米螟unigenes数据库。从unigenes数据库中选取了13个基因片段进行克隆,结果表明:其中12个基因片段被成功克隆。同时我们对此过程中亚洲玉米螟幼虫中肠进行了定量蛋白质自学研究。在中肠中发现了42个差异表达蛋白,其中上调蛋白上调蛋白26个,下调蛋白16个;在内含物中共发现了19个差异表达蛋白,其中上调蛋白7个,下调蛋白12个。同时我们还发现了19个蛋白,这19个蛋白在不同的处理条件下,在中肠和内含物中的含量比例不同。对这些蛋白的功能分析表明:这些差异表达蛋白具有不同的功能。这暗示了:亚洲玉米螟的取食相应过程是一个多蛋白多网络的响应过程。与此同时我们结合了unigenes数据库对部分编码差异表达蛋白基因片段进行克隆。为今后的研究奠定了基础。谷胱甘肽-S-转移酶(GST)是昆虫体内一类重要的解毒酶系。在昆虫抗逆响应中具有重要作用。本实验通过使用家蚕GST蛋白序列在unigenes数据库中进行本地blast比对。预测了8条亚洲玉米螟GST相关蛋白编码基因片段。并成功克隆了其中的6条。分别命名为:OfGSTd3, OfGSTd2, OfGSTel, OfGSTol, OfGSTo4, OfGSTe2,, OfGSTsl, OfGST-GP。通过结合不同的比对序列构建亚洲玉米螟GSTs系统进化树,结果表明除OfGSTd2外其余的GSTs相关蛋白均可明确的进行家族分类。之后,采用RT-PCR,我们探索了个GST基因在各龄幼虫中的表达情况的变化。同时,结合本实验室的先前研究,我们探索了我们已有的亚洲玉米螟GST相关基因在亚洲玉米螟三龄幼虫取食响应中表达情况的变化。之后,使用QRT-PCR和Western Blot技术探索玉米内生杀虫物质丁布对本实验室先前发现的亚洲玉米螟OfGSTdl基因的诱导表达作用;并通过构建RNAi干扰工程菌株。并使用丁布丁布饲喂试验验证RNAi工程菌的功能。相应实验结果表明:在丁布诱导可导致亚洲玉米螟OfGSTdl表达水平升高;干扰OfGSTdl后亚洲玉米螟对丁布的解毒能力减弱。这表明:亚洲玉米螟OfGSTD1蛋白可能参与亚洲玉米螟对丁布的解毒过程。与此同时,我们构建了OfGSTel基因的]RNAi干扰工程菌株,并结合几种农药进行功能验证,结果表明在高效氯氰菊酯自然饲喂实验组中,干扰组的死亡率显著高于对照组。这暗示了亚洲玉米螟OfGSTel蛋白可能参与亚洲玉米螟幼虫对高效氯氰菊酯的解毒构成。
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